论文摘要
研究目的神经退行性疾病（neurodegenerative disorders,NDDs）是一类慢性、进行性神经系统疾病。本世纪以来,在发达国家人们的预期寿命明显延长,NDDs已迅速成为人类面临的主要健康问题之一。然而,迄今为止NDDs的发病机制还未十分清楚,神经细胞内Ca2+超载(Ca2+overload)被认为是NDDs发生发展的重要机制之一。神经细胞内升高的Ca2+可激活Ca2+依赖信号级联反应,从而导致神经细胞坏死或凋亡。本课题将重点研究以下四个方面的问题:1.体外培养大鼠皮层神经细胞,建立与NDDs发病机制有关的损伤模型,研究超低分子量肝素（ultra low molecular weight heparin,ULMWH）对损伤神经细胞的作用;2.研究ULMWH对谷氨酸（glutamate,Glu）诱发神经细胞凋亡的作用;3.制备乳大鼠脑细胞悬液和体外培养大鼠大脑皮层神经细胞悬液,研究ULMWH对神经细胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)的影响;4.采用亚细胞分级分离法和蔗糖密度梯度离心法,分离内质网（endoplasmicreticulum,ER）和线粒体（mitochondria,Mit）,直接在细胞器水平上研究ULMWH对1,4,5-三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphospate,IP3）诱导的神经细胞内Ca2+释放的影响。通过阐明上述问题,旨在明确ULMWH的神经细胞保护作用及其可能的分子机制,为NDDs的防治提供有效的治疗措施。研究方法1.体外培养胚胎大鼠大脑皮层神经细胞,建立Glu、叠氮钠、KCl和咖啡因等4种损伤模型,模拟NDDs的发病机制,以细胞生存率和培养液中LDH活性作为观察指标测定神经细胞活力,研究ULMWH对损伤神经细胞的作用。2.体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,建立Glu诱导的神经细胞凋亡模型,研究ULMWH对Glu诱导神经细胞凋亡的作用。①采用Hoechst33258染色法观察凋亡细胞形态改变和检测凋亡细胞数;②Annexin V/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;③DNA ladder评价细胞凋亡;④蛋白免疫印迹（Western blot）法测定Bcl-2/Bax蛋白和神经细胞Mit细胞色素C（cytochrome c,Cyt C）释放以及半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）表达;⑤罗丹明123（Rhodamine 123,Rh123）染色流式细胞术测定细胞Mit膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）3.制备乳大鼠脑细胞悬液和体外培养大鼠大脑皮层神经细胞悬液,Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM负载细胞悬液,检测细胞悬液的荧光强度,研究ULMWH对神经细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响。4.分离新生大鼠脑细胞并制备细胞悬液,采用亚细胞分级分离法和蔗糖密度梯度离心法,制备神经细胞细胞器（ER和Mit）悬液,Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM孵育细胞器悬液,以IP3作为外源性Ca2+释放剂,研究ULMWH对IP3诱导的神经细胞内Ca2+释放的影响。结果1.ULMWH对神经细胞的作用（1）100μmol·L-1Glu作用24 h,神经细胞生存率明显降低,培养液中LDH活性明显升高,表明Glu对神经细胞产生损伤作用;与Glu模型组相比,预孵ULMWH可明显升高神经细胞生存率和降低培养液中LDH活性,表明ULMWH可对Glu损伤神经细胞产生明显的保护作用。（2）64 mmol·L-1叠氮钠作用4 h,神经细胞生存率明显降低,培养液中LDH活性明显升高,表明叠氮钠对神经细胞产生损伤作用;与叠氮钠模型组相比,预孵ULMWH 1 mg·L-1可提高神经细胞生存率和降低培养液中LDH活性,表明ULMWH可对叠氮钠损伤神经细胞有保护作用。（3）200 mmol·L-1KCl作用20 min,或咖啡因10 mmol·L-1作用30 min,神经细胞生存率明显降低,培养液中LDH活性明显升高,表明KCl和咖啡因造成神经细胞损伤。与KCl组或咖啡因模型组相比,预孵ULMWH对神经细胞生存率和培养液中LDH活性无明显影响,结果表明ULMWH可对KCl和咖啡因损伤神经细胞无明显保护作用。2.ULMWH对谷氨酸诱导神经细胞凋亡的影响（1）Hoechst33258染色Hoechst33258染色后,正常神经细胞的细胞核呈卵圆形,荧光显微镜下呈现均匀的蓝色荧光:凋亡的细胞皱缩变圆、染色质浓集或碎裂或出现凋亡小体,呈明亮的蓝色荧光。凋亡计数显示,正常对照组约19.9%的细胞发生凋亡,而在Glu模型组约有33.21%的细胞发生凋亡,与正常对照组相比有显著性差异。ULMWH处理组约有19.45%的细胞发生凋亡,与正常对照组相比无明显差异。ULMWH(1 mg·L-1)预处理组凋亡细胞约有20.47%的细胞发生凋亡,与正常对照组相比无明显差异,与Glu处理组相比有显著性差异,表明预孵ULMWH可明显减少Glu诱导的凋亡细胞。（2）Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率细胞同时进行Annexin标记的异硫氰酸荧光素（FTTC）染色和PI染色,以区分活细胞（Annexin-/PI-）、凋亡细胞（Annexin+/pI-）和继发性坏死细胞（Annexin+/PI+）。在空白对照组,3.69%的神经细胞发生典型的细胞凋亡。Glu模型组约有20.91%的细胞发生凋亡,而预孵低、中、高浓度ULMWH时凋亡细胞数分别为12.7%、7.01%、6.13%,表明预孵ULMWH可明显减少Glu诱导的凋亡细胞。（3）DNA ladder和easpase-3表达100μmol·L-1。Glu作用于神经细胞24 h后,DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的DNA梯状条带（DNA ladder）现象,同时Western blot检测结果可见caspase-3表达增加达56%。预孵1 mg·L-1ULMWH后再用100μmol·L-1Glu作用神经细胞24 h则未出现典型的DNA梯状条带现象,同时caspase-3表达明显降低。对照组和ULMWH处理组之间的caspase-3表达水平无明显的差别。（4）神经细胞Bcl-2和Bax蛋白表达100μmol·L-1Glu作用于神经细胞24h后,经Western blot检测结果可见Bcl-2蛋白水平明显减低,而Bax蛋白表达水平明显增加,Bcl-2/Bax比值下降。预孵1 mg·L-1ULMWH,Bcl-2蛋白水平明显升高,而Bax蛋白表达水平明显下降,Bcl-2/Bax比值升高。正常对照组和ULMWH处理组之间的Bcl-2和Bax蛋白表达水平并无明显的差别。（5）神经细胞线粒体膜电位（MMP）正常对照组神经细胞内Rh123荧光强度约为1483.17,而100μmol·L-1Glu作用神经细胞24 h后神经细胞内Rh123荧光强度约为84.44,约为正常组的5.87%,提示Glu可诱导Mit膜去极化而对神经细胞Mit产生损伤。预孵低、中、高浓度ULMWH后神经细胞内Rh123荧光强度分别约为285.66、593.13和847.07,分别约为正常组的20.12%,39.97%和57.93%,较Glu组均有明显增加,提示ULMWH可抑制Glu诱导的Mit膜去极化而对损伤的Mit产生明显的保护作用。（6）神经细胞细胞色素C释放Western blot检测证明,100μmol·L-1Glu作用于神经细胞24 h后,Mit Cyt C水平明显降低而胞浆Cyt C水平明显升高,表明Glu可增加神经细胞Cyt C的释放。预孵1 mg·L-1ULMWH后,Mit Cyt C水平明显升高而胞浆Cyt C水平明显降低,表明ULMWH可抑制Glu诱导的神经细胞Cyt C释放。3.ULMWH对神经细胞内钙离子浓度的影响（1）ULMWH对乳大鼠神经细胞内钙离子浓度的影响1)ULMWH对神经细胞静息钙离子浓度的影响细胞外液含正常浓度Ca2+(1.3 mmol·L-1)时,神经细胞[Ca2+]i静息值为137.68±10.36 nmol·L-1;预孵0.1和1 mg·L-1ULMWH可明显降低神经细胞静息[Ca2+]i。细胞外液无Ca2+(含1mmol·L-1EGTA)时,神经细胞[Ca2+]i静息值为97.97±9.44 nmol·L-1;预孵0.1和1 mg·L-1ULMWH仍可降低神经细胞静息[Ca2+]i,表明ULMWH引起的神经细胞静息[Ca2+]i降低与其抑制神经细胞内贮存的Ca2+释放有关。2)ULMWH对谷氨酸诱导的神经细胞钙离子浓度升高的影响细胞外液含正常浓度Ca2+(1.3 mmol·L-1)时,100μmol·L-1Glu可引起大鼠神经细胞[Ca2+]i升高至267.92±6.49 nmol·L-1,升高93.7%;预孵ULMWH 0.1和1 mg·L-1ULMWH可明显降低Glu引起的大鼠神经细胞[Ca2+]i的升高,与Glu模型组相比具有显著性差异。细胞外液无Ca2+(含1 mmol·L-1EGTA)时,100μmol·L-1Glu仍可引起大鼠神经细胞[Ca2+]i升高,但升高幅度远低于细胞外液含Ca2+时,表明Glu诱导的[Ca2+]i升高部分与刺激细胞内Ca2+释放有关;预孵ULMWH仍可明显降低Glu引起的大鼠神经细胞[Ca2+]i的升高,与Glu组相比有显著性差异,表明ULMWH降低Glu诱导的[Ca2+]i升高与其抑制Glu诱导的细胞内Ca2+释放有关。3)ULMWH对KCl诱导的神经细胞钙离子浓度升高的影响本实验选用200mmol·L-1KCl作为刺激浓度,在细胞外液无Ca2+时,不能升高[Ca2+]i,说明KCl不能诱发细胞内贮存的Ca2+释放。但在细胞外液含正常浓度Ca2+(1.3 mmol·L-1)时,KCl可使[Ca2+]i升高至248.36±10.67 nmol·L-1,升高近80%,表明KCl可刺激神经细胞外Ca2+内流。预孵ULMWH,虽可略微降低KCl诱导的细胞[Ca2+]i的升高,但与KCl模型组相比无显著性差异,表明ULMWH不能对细胞外Ca2+内流产生抑制作用。4)ULMWH对咖啡因诱导的神经细胞钙离子浓度升高的影响10 mmol·L-1咖啡因可使神经细胞[Ca2+]i升高至248.36±10.67 nmol·L-1。预孵ULMWH后,虽略微降低咖啡因诱导的细胞[Ca2+]i的升高,但与咖啡因组相比无显著性差异,表明ULMWH不能对咖啡因介导的细胞内Ca2+释放产生抑制作用。（2）ULMWH对谷氨酸诱导体外培养皮层神经细胞内钙离子浓度升高的影响与正常组相比,Glu处理组神经细胞[Ca2+]i明显升高,说明在本实验条件下Glu可致皮层神经细胞[Ca2+]i升高。在Glu损伤前24 h加入1 mg·L-1ULMWH可部分抑制Glu诱导的皮层神经细胞[Ca2+]i升高,但与Glu模型组相比仍有显著性差异。将细胞外液换为无Ca2+测量介质(含1 mmol·L-1EGTA),再应用Glu仍可诱发神经细胞[Ca2+]i升高,但升高幅度远低于在含Ca2+测量介质中诱导[Ca2+]i升高的幅度,表明Glu诱导的[Ca2+]i升高部分与刺激细胞内Ca2+释放有关。在无Ca2+测量介质中,于Glu损伤前24 h加入ULMWH可完全抑制Glu诱导的神经细胞[Ca2+]i升高。而且,ULMWH在无Ca2+测量介质中降低神经细胞[Ca2+]i的幅度几乎与在含Ca2+测量介质中降低神经细胞[Ca2+]i的幅度接近,表明ULMWH降低Glu诱导的神经细胞[Ca2+]i升高与其抑制神经细胞内贮存的Ca2+释放有关。4.ULMWH对IP3诱导神经细胞内钙释放的影响（1）ULMWH对IP3诱导内质网钙离子释放的影响10μmol·L-1IP3可使ER网悬液中Ca2+浓度明显升高,由200.14±6.89 nmol·L-1升至292.43±12.04nmol·L-1,表明IP3可诱导Ca2+从ER释放。当ER悬液与ULMWH预孵后,再应用IP3刺激,Ca2+从ER的释放受到明显抑制。当ULMWH的浓度达到1 mg·L-1时,抑制率为60.3%。（2）ULMWH对IP3诱导线粒体钙离子释放的影响10μmol·L-IP3可引起Mit悬液中的[Ca2+]明显升高,由198.86±7.09 nmol·L-升至241.20±6.68 nmol·L-,表明IP3可诱导Ca2+从Mit释放。当Mit悬液与ULMWH孵育5 min后,再应用IP3刺激,Ca2+从Mit的释放明显受到抑制。当ULMWH的浓度达到1 mg·L-时,抑制率达到57.29%。结论1.ULMWH可提高Glu和叠氮钠损伤神经细胞的生存率,并降低培养液中LDH的活性,对损伤神经细胞可产生保护作用。2.ULMWH可改善Glu诱导凋亡神经细胞的形态,降低凋亡神经细胞数目,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,抑制Caspase 3的激活、升高MMP和抑制Cyt C的释放,产生明显的拮抗Glu诱导神经细胞凋亡作用。3.ULMWH可降低Glu升高的神经细胞[Ca2+]i,不能降低KCl诱导的细胞外Ca2+内流;并且,可降低无Ca2+Hanks液中神经细胞静息[Ca2+]i和无Ca2+培养基中Glu升高的神经细胞[Ca2+]i。因此,ULMWH降低神经细胞[Ca2+]i的机制可能与抑制神经细胞内Ca2+释放有关。4.ULMWH可抑制IP3诱导的Ca2+从ER和Mit释放。