C-8，7甾醇异构酶基因的克隆表达及功能研究

论文摘要

本研究采用生物信息学技术,利用RT-PCR扩增结合3’RACE克隆获得一个大麦来源的C-8,7甾醇异构酶基因HvSI,并对该基因的结构特点、表达特性进行了研究。在此基础上,利用农杆菌介导分别将Ubiqutin基因启动子的启动、水稻谷蛋白基因启动子的启动,以及GFP示踪和RNAi形式的C-8,7甾醇异构酶基因导入粳稻品种kitaake中,探索该基因的功能,尤其是与植物甾醇合成的关系。有关研究结果如下:1、大麦C-8,7甾醇异构酶基因的克隆及其结构特点、表达特性提取发芽三天大麦幼芽的RNA,反转录后采用RT-PCR法扩增获得大麦C-8,7甾醇异构酶基因,序列分析显示该目的片段全长为972 bp,包含一个长度为651 bp,编码216个氨基酸残基的开放阅读框,分子量约为24.2 kD,等电点为8.75,属于碱性蛋白。选取发芽8天和花后20天的大麦提取不同部位的RNA,进行表达特性分析,发现该基因在大麦生长旺盛的分生组织中的表达量较高,而在衰老部位的表达量很低。然后对其进行时空表达特性分析,该基因在大麦萌发两天就可以表达,至第8天表达量达到最高,此后表达量有所降低。2、C-8,7甾醇异构酶体外表达载体的构建和重组蛋白的获得分别构建了带有HvSI基因信号肽和去除信号肽序列的PGEX-4T-HvSI融合蛋白表达载体,利用宿主菌大肠杆菌BL21菌株对其进行体外表达,表达产物总蛋白经SDS-PAGE电泳检测证实该融合基因能够在原核系统中表达出相应的融合蛋白,其中带有HvSI基因信号肽的融合蛋白大小约为44kD,而不带HvSI基因信号肽的融合蛋白大小约为41kD。3、外源目的基因多种表达形式的转基因水稻植株的获得以农杆菌介导将Ubiqutin基因的启动、水稻谷蛋白基因启动子的启动、以及GFP示踪和RNAi形式的C-8,7甾醇异构酶基因四种类性的载体,以及空载体导入水稻中并分别获得了13株、12株、13株、25株和3株再生苗,特异性PCR鉴定证实外源目的基因已整合进入受体植株基因组,转基因阳性检测率平均达到95%。4、外源目的基因在转基因水稻中的表达利用定量RT-PCR分别对过量表达类型的转基因水稻中外源目的基因的表达部位、表达水平进行检测,结果发现:外源基因在转基因水稻中的不同组织部位都得到了表达,特别是在水稻的茎和叶片中的表达量最高,而在水稻的胚乳和根中的表达量较低,在对照的不同组织部位中未发现相应的目的条带。同时发现,不同株系的转基因水稻同一部位的表达量也存在着差异,说明同一基因在不同株系的表达量是不相同的。另外发现外源基因的过量表达影响了植株的生长和籽粒的充实度,而基因敲除类型的转基因水稻生长较旺,分蘖较多,同时籽粒的结实性较好。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 甾醇的结构及药用功能
• 1.2 植物甾醇的分类
• 1.3 植物甾醇与抗氧化性
• 1.4 植物甾醇与心血管系统
• 1.5 植物甾醇与植物衰老
• 1.6 植物甾醇的提取方法
• 1.6.1 混合植物甾醇提取方法
• 1.6.2 植物甾醇精制及单体分离方法
• 1.6.3 溶剂结晶法
• 1.6.4 分子蒸馏技术
• 1.7 植物甾醇与基因工程
• 1.8 植物甾醇合成关键酶基因的调控
• 第二章 大麦C-8,7甾醇异构酶基因克隆及其表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂和材料
• 1.2 大麦种子发芽
• 1.3 大麦幼苗总RNA的提取及cDNA第一条链的合成
• 1.3.1 大麦种子RNA的提取
• 1.3.2 RNA的纯度检测
• 1.3.3 cDNA第一条链的合成
• 1.4 大麦C-8,7甾醇异构酶基因的cDNA克隆
• 1.4.1 基因片断PCR扩增
• 1.4.2 PCR扩增产物的检测与回收纯化
• 1.4.3 回收产物与pBS-T载体的连接
• 1.4.4 重组载体对大肠杆菌的转化
• 1.4.4.1 感受态细胞的制备（Ca-Mn法）:
• 1.4.4.2 DNA的热击转化
• 1.4.5 重组质粒的鉴定
• 1.4.5.1 碱裂解法小量提取质粒
• 1.4.5.2 重组质粒的PCR鉴定
• 1.5 序列的测定
• 1.6 定量RT-PCR分析
• 2 结果分析
• 2.1 大麦C-8,7甾醇异构酶基因克隆及序列分析
• 2.1.1 大麦幼芽总RNA的提取
• 2.1.2 大麦C-8,7甾醇异构酶基因的cDNA克隆及序列分析
• 2.3 C-8,7甾醇异构酶基因的表达特性分析
• 2.3.1 大麦HvSI1的时空表达特性
• 2.3.2 大麦HvSI在衰老组织中的表达特性
• 3 讨论
• 第三章 大麦C-8,7甾醇异构酶基因体外表达及活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、载体及试剂
• 1.2 原核生物培养基的配制
• 1.3 HvSI基因体外表达载体构建
• 1.3.1 PCR扩增和产物的回收
• 1.3.2 PCR产物和原核表达载体PGEX-4T的酶切
• 1.3.3 PGEX-4T表达载体的连接
• 1.3.4 感受态细胞的制备与转化
• 1.3.5 重组质粒的鉴定
• 1.3.6 表达载体PGEX-4T-HvSI1及PGEX-4T-HvSI2转化表达菌株BL21
• 1.4 SDS-PAGE电泳细胞总蛋白检测分析
• 1.4.1 SDS-PAGE电泳所需试剂的配制
• 1.4.2 细胞总蛋白质的电泳检测和分析
• 2 结果分析
• 2.1 原核表达载体的构建及验证
• 2.2 原核表达产物的SDS-PAGE电泳结果分析
• 3 讨论
• 第四章 大麦C-8,7甾醇异构酶基因的功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 受体材料
• 1.2 载体、菌株和试剂
• 1.3 水稻培养基的配制
• 1.4 HvSI基因植物转化载体的构建
• 1.5 根癌农杆菌介导法遗传转化水稻
• 1.5.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备转化
• 1.5.2 种子的消毒和愈伤组织的诱导
• 1.5.3 农杆菌介导水稻转化
• 1.6 转基因植株的初步鉴定
• 1.6.1 转基因水稻总DNA的提取
• 1.6.2 转基因植株的PCR鉴定
• 1.7 转基因水稻外源目的基因转录水平表达检测
• 2 结果分析
• 2.1 真核表达载体的构建
• 2.1.1 真核表达载体pUbi::HvSI1的构建
• 2.1.2 真核表达载体pUbi::HvSI-RNAi的构建
• 2.1.3 真核表达载体pubi::HvSI-GFP的构建
• 2.1.4 真核表达载体pGluB7::HvSI的构建
• 2.2 C-8,7甾醇异构酶基因对水稻遗传转化的研究
• 2.2.1 水稻胚性愈伤的获得
• 2.2.2 抗性愈伤组织筛选及植株再生
• 2.2.3 转基因植株的PCR鉴定
• 2.2.4 过量表达转基因水稻不同部位表达特性分析
• 3 讨论
• 第五章 全文小结
• 5.1 大麦C-8,7甾醇异构酶基因的克隆及其结构特点、表达特性
• 5.2 C-8,7甾醇异构酶体外表达载体的构建和重组蛋白的获得
• 5.3 四种植物转化载体的构建
• 5.4 外源目的基因多种表达形式的转基因水稻植株的获得
• 5.5 展望
• 参考文献
• 英文摘要