论文摘要
烟草普通花叶病和烟草马铃薯Y病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类主要病害,也是我国北方烟区的主要病毒病害,尤其对我国黄淮烟区和东北烟区的影响较为严重,他们严重影响烟叶的产量和品质,而且在烟株上经常复合侵染,加大病害的防治难度。选育抗病品种是生产中防治病害的主要手段,但存在着抗性资源狭窄、抗病品种选育时间慢等诸多局限,不能有效地控制复合侵染对烟草生产带来的危害。随着分子生物学的发展,RNA干涉技术为病毒病害的防治提供了一条新途径。为了解决TMV和PVY复合侵染对烟草生产带来的危害,本试验以RNAi机制为依据,设计了双基因融合的RNAi靶序列,并成功构建植物双元表达载体系统。农杆菌侵染叶盘,最终获得9株转基因烟草苗。经PCR检测、TMV与PVY病毒验证,3株转基因烟草对TMV和PVY具有免疫级抗性。证实了以RNAi为基础的双基因融合策略在增强植物抵抗两种病毒侵染方面的效果。本试验主要内容如下:1.TMV和PVY目的序列的克隆分别对TMV和PVY外壳蛋白基因序列进行Blast序列比对,找出TMV、PVY外壳蛋白基因的保守序列,针对各自的保守序列确定进行融合的目的序列,设计TMV与PVY目的序列引物TMV-m/TMV-n;PVY-m/PVY-n。通过重新接种鉴定TMV与PVY病毒致病性后,分别提取TMV和PVY的总RNA,经RT-PCR反应获得TMV与PVY外壳蛋白基因的cDNA序列,应用TMV与PVY目的序列引物进行PCR扩增,产物连接进入pMD18-T Simple Vector,转化到大肠杆菌中扩繁,获得进行融合的TMV、PVY目的序列。2.目的基因的融合利用限制性内切酶对含有TMV片段的T载体质粒DNA和含有PVY片段的T载体质粒DNA进行双酶切;分别回收含TMV片段的pMD18-T载体质粒大片段和PVY小片段。然后两个DNA片段经T4 DNA Ligase连接,产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中扩繁,获得双基因融合的RNAi靶序列。3.构建RNAi双元载体系统采用酶切后连接方法,根据RNAi载体多克隆位点及目的序列边缘的相同酶切位点,构建含双基因融合序列（TMV-PVY-r）正反向重复结构的中间载体（pUCCRNAi-TMV-PVY-2）和表达载体（pC2300-35S-OCS-TMV-PVY-2）。分别以TMV-m,TMV-n/PVY-m,PVY-n;35S-F/35S-R超强启动子引物进行PCR扩增验证、限制性内切酶酶切验证,证实连接正确后经大肠杆菌扩繁,提取质粒转化农杆菌LBA4404感受态细胞。完成RNAi双元载体系统构的构建。4.农杆菌介导法转化烟草利用叶盘转化法,将试验获得的RNAi工程农杆菌侵染无菌烟草叶圆片,成功筛选出抗卡那霉素烟草个体86株并将其移栽至温室培养。5.分子生物学检测转基因烟草及转基因烟草的抗性验证利用改良CTAB法提取转基因烟草DNA,分别以特异引物（TMV-m/TMV-n;PVY-m/PVY-n）与超强启动子引物（35S-F/35S-R）对卡那霉素抗性材料进行PCR鉴定,确定9株转基因烟草苗为阳性。初步证实目的基因已经插入烟草基因组DNA中,利用人工接种TMV和PVY进行转基因烟草的抗病性鉴定。结果表明:转TMV和PVY外壳蛋白基因阳性个体的抗病性明显高于阴性的非转基因烟草,并且有3株达到了免疫级水平。6.荧光定量PCR分析双基因融合RNAi效果选择免疫级抗性的转基因烟草3株,田间未感染TMV与PVY的正常烟草1株,田间感染TMV与PVY的烟草1株,提取各自总RNA,经荧光定量PCR反应分析证实:三株免疫级抗性转基因烟草的TMV与PVY病毒外壳蛋白基因的mRNA拷贝数均低于接种的对照植株,说明RNAi确实引起了TMV与PVY外壳蛋白基因转录产物mRNA的降解,双基因融合干涉成功。为RNAi在抵抗多种病毒侵染方面提供了理论基础。7.得到T0代转基因烟草并获得了T1代转基因材料。
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标签：双基因融合干涉论文; 烟草花叶病毒论文; 烟草马铃薯病毒病论文; 载体构建论文;