捻转血矛线虫基因Hc38保守结构域所在部分的克隆、表达及免疫保护性试验

论文摘要

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是毛圆科（Trachostrongylidae）血矛属（Haemonchus）消化道线虫,感染牛、绵羊、山羊及其他反刍动物,引起动物贫血及贫血综合症,严重的可致动物,特别是羔羊大批死亡,给畜牧业生产带来巨大经济损失。目前,主要采用化学药物治疗该病,但药物残留严重,加之抗药性虫株的出现和蔓延,使得化学治疗方法受到了严重挑战。应用免疫学方法防治该病十分迫切和必要。Hc38基因在捻转血矛线虫肠上皮微绒毛内高丰度表达,据推测它的表达产物是一种重要的功能蛋白,与其吸血和免疫逃避机制有关。该基因表达产物的196-512位氨基酸构成的保守结构域属于功能未知的蛋白家族pf04910,该家族目前有71条蛋白序列登录在GeneBank上,它们分属于45种生物,其中的14种为人类或动物的重大血源性疫病病原或传播媒介。GenBank中注册了该抗原基因的全序列,然而他的功能国内尚无相关资料报道。为此,作者开展了以下研究:1.捻转血矛线虫Hc38保守结构域部分基因的克隆、鉴定及分析根据GenBank发表的捻转血矛线虫Hc38基因序列,设计1对引物。以绵羊捻转血矛线虫雌性成虫总RNA为模板,采用RT- PCR技术,扩增出大小约为429bp的产物,回收目的片段并克隆入pMD 19-T载体,通过限制性内切酶NcoI和EcoRI双酶切、PCR、序列测定等方法对重组子进行鉴定:测序结果与GenBank中AY749124序列同源性为99%。2.捻转血矛线虫Hc38保守结构域部分基因的原核表达及重组蛋白特异性分析将Hc38保守结构域部分所在基因亚克隆到原核表达载体pPROEXHTa,双酶切和PCR鉴定筛选出阳性重组质粒。IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现重组Hc38保守结构域蛋白在DH5a中表达,且以包涵体形式存在。重组蛋白变性、复性、纯化后,通过Western blot测定具有免疫特异性。3.捻转血矛线虫重组Hc38保守结构域部分基因抗原绵羊免疫保护性试脸将重组Hc38保守结构域免疫绵羊后,ELISA检测结果表明血清抗体均在首次免疫后12天达到较高水平,二免后第10天达到高峰。用30000条捻转血矛线虫第三期幼虫攻击后,对不同组绵羊排出虫卵数、虫卵孵化率和成虫数进行统计分析,结果表明:免疫组和对照组在虫卵孵化率、成虫计数等方面差异显著（p<0.05）,尤其是雄虫数减少明显。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 引言
• 第一章 文献综述
• 文献综述（一） 动物寄生虫疫苗的研究进展
• 文献综述（二） 捻转血矛线虫与其抗原Hc38 基因研究状况
• 第二章 实验研究
• 实验一 捻转血矛线虫基因Hc38 保守结构域所在部分的克隆及序列分析
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 实验二 捻转血矛线虫基因Hc38 保守结构域所在部分原核表达及重组蛋白分析
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 实验三 捻转血矛线虫重组基因Hc38 保守结构域所在部分抗原绵羊免疫保护性试验.
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第三章 结论
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 导师评阅表