hKLK1基因转移对血管平滑肌细胞增殖、迁移和球囊损伤后SHR颈动脉新生内膜的影响

论文摘要

目的构建含人组织激肽释放酶（human tissue kallikrein 1,hKLK1）基因的重组腺病毒载体及检测其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）中表达;探讨hKLK1基因转移对血小板源性生长因子-BB（platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）诱导下的VSMCs增殖、迁移和球囊拉伤后SHR颈总动脉新生内膜的影响及其机制。方法: 1通过双酶切含目的基因hKLK1的质粒pBluescritII KS-hKLK1,将目的基因克隆至带有强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因为报告基因的穿梭质粒中,构建成重组穿梭质粒,与腺病毒骨架质粒在293A细胞中包装成双顺反子重组腺病毒载体。2组织块体外培养SHR大鼠胸主动脉VSMCs,采用荧光显微镜和流式细胞仪检测病毒感染率;RT-PCR法测定hKLK1和缓激肽B1受体、B2受体的mRNA表达、;蛋白免疫印迹法（Western-blotting,WB）测定hKLK1和细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。3细胞计数法和四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期;采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCs迁移。4动物实验:30只350-450g雄性SHR随机分为四组:假手术组6只、单纯拉伤组8只、拉伤+空载体病毒组8只、拉伤+Ad-hKLK1组8只。除假手术组外,其余各组用2F球囊导管从颈外动脉进入颈总动脉并拉伤,将Ad-hKLK1重组腺病毒和空载体病毒（1×109IU/只,在50μl病毒保存液里）,用微量注射器迅速注入动脉损伤段,孵育30-45分钟后恢复血流。4周末处死后大鼠,冰冻切片在荧光显微镜下观察绿色荧光表达;HE染色,计算机图像分析颈总动脉,计算血管壁腔面积比（W/L）,内膜/中膜面积比（I/M）;RT-PCR法检测颈动脉缓激肽受体B1和B2的表达,WB法检测动脉hKLK1和p27Kip1、p21Cip1的蛋白表达。结果:第一部分:经PCR、双酶切和测序鉴定表明,携目的基因hKLK1的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP和空载体病毒Ad-IRES-EGFP。重组腺病毒感染VSMCs后,荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光,呈感染复数（multiplicity of infection,MOI）（20-100MOI）和时间（1d-5d）依赖性增强;流式细胞仪结果示,VSMCs感染率也随MOI递增而增加,当MOI为100,感染率达99%。RT-PCR、WB检测结果示:VSMCs中hKLK1的mRNA和蛋白均有表达,也与感染时间呈显著依赖关系,3-5天达峰值;MOI为100时hKLK1的表达达高峰。第二部分:1 hKLK1基因转移对PDGF诱导的VSMCs的增殖影响:1)通过细胞计数显示,hKLK1基因转移呈感染复数依赖性（20-100MOI）抑制PDGF-BB诱导的VSMCs生长,100MOI时抑制率为39.3%;同时呈时间依赖性抑制VSMCs生长,第5天时达高峰,抑制率为35.2%。空载体病毒组和单纯PDGF-BB组之间未见明显差异。2) MTT法和流式细胞仪检测的结果显示,hKLK1基因转移可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖,峰值抑制率为30.2%（P<0.01）;细胞周期阻滞于G0/G1期的VSMCs明显增多,最大阻滞率为36.4%（P<0.001）。同时,hKLK1基因转移可明显上调PDGF-BB诱导VSMCS的p27Kip1、p21Cip1表达。而缓激肽B2受体特异性阻断剂Hoe140明显消除hKLK1基因转移对VSMCs增殖和细胞周期的抑制作用,并降低p27Kip1、p21Cip1表达。2 hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCS细胞迁移,抑制率为34.6%,而Hoe140不影响其抑制迁移效应。3 PDGF-BB诱导VSMCs的缓激肽B2受体的mRNA表达明显增加（p<0.001）;而Hoe140可明显降低其表达（p<0.01）,与对照组间无显著性差异。缓激肽B1受体的mRNA表达在各组间无明显性改变。第三部分:1 hKLK1基因转移可明显改善球囊拉伤后大鼠颈总动脉的壁腔面积比（W/L）,抑制率达35.6%（P<0.001）;内膜/中膜面积比（I/M）改善达38.8%（P<0.001）。而在单纯拉伤组和空载体病毒组之间无显著差异。2 hKLK1基因转移能增加颈总动脉内p27Kip1、p21Cip1的蛋白表达（p<0.001）,而单纯拉伤组和空载体病毒组之间无显著差异。3球囊拉伤后颈动脉的缓激肽B2受体的mRNA表达明显高于假手术组（p<0.01）,而各组间的缓激肽B1受体的mRNA表达无显著性差异。结论:1成功构建并包装含目的基因hKLK1和标志基因EGFP的双顺反子重组腺病毒载体Ad-hKLK1-IRES-EGFP,两基因在VSMCS上均获得高表达,为hKLK1基因治疗研究提供直观、快捷的观察和检测手段。2 hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCS增殖,主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表达的途径。而hKLK1基因转移抑制VSMCS迁移效应,可能由缓激肽B1受体介导。3在球囊拉伤SHR颈动脉的血管再狭窄模型中,hKLK1基因转移主要也是通过缓激肽B2受体介导的下游途径,上调p27Kip1、p21Cip1的表达,从而抑制新生血管壁的增厚。4本研究提示,hKLK1基因转移减轻SHR颈动脉球囊损伤后的新生血管内膜形成,可能主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调p27Kip1、p21Cip1的表达,抑制VSMCS增殖和迁移等途径实现的,为血管增殖性疾病提供另一条可能的基因治疗途径。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 构建含hKLK1和EGFP基因的双顺反子重组腺病毒载体及其在血管平滑肌细胞中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 探讨hKLK1基因转移对SHR血管平滑肌细胞增殖、迁移影响及其机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 hKLK1 基因转移对球囊损伤后 SHR 血管内膜增生的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述 组织激肽释放酶的心血管保护作用及其基因治疗进展
• 致谢
• 在读期间发表论文