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根癌农杆菌介导R-Fom-2基因转化新疆甜瓜的研究

2020-12-01阅读(596)

根癌农杆菌介导R-Fom-2基因转化新疆甜瓜的研究

论文摘要

新疆甜瓜（Cucumis melo L.）以其品质独特在国内外享有盛誉。但近年来,甜瓜病害尤其是真菌病中的枯萎病严重影响了甜瓜的产量和品质。目前防治甜瓜病害的主要途径仍然是运用化学方法,这对人类的健康和生活环境存在巨大的潜在威胁。利用传统的杂交育种方法培育适合种植的抗性品种耗时费力,相对发展往往滞后,利用基因工程实现抗病育种是一种有着广泛应用前景的新途径。本实验室于2006年从抗枯萎病甜瓜品种“日本安农二号”克隆得到R-Fom-2基因（DQ287965）,是甜瓜抗枯萎病基因Fom-2的同源序列,以其核心片段X-Fom-2为探针进行Northern杂交表明,R-Fom-2在感病品种中不进行表达,在抗病品种中有较高水平表达,而且表达受病原菌侵染的诱导,初步证明我们所克隆得到的R-Fom-2基因可能在新疆甜瓜抗枯萎病中起作用。本文以新疆厚皮甜瓜皇后为材料,利用农杆菌介导法,对甜瓜转R-Fom-2基因进行了研究。通过中间载体pMD18-T将R-Fom-2基因克隆到植物双元表达载pCAMBIA 13011上,构建R-Fom-2基因的植物表达载体pCA-Fom-2,并利用冻融法将pCA- Fom-2转入根癌农杆菌LBA4404。优化了新疆厚皮甜瓜皇后的组织培养再生体系。以子叶为外植体,培养基为MS+ 6-BA 1.0 mg/L,外植体在该培养基上培养1个月左右直接出芽,其中每20天继代一次。生根培养基为MS+IAA 0.1mg/L培养基。利用农杆菌介导法导入了R-Fom-2基因,建立甜瓜遗传转化体系,确定Carb 500 mg/L能有效地抑制农杆菌的生长,Hyg 10 mg/L是最佳选择压,子叶块预培养2-3 d、农杆菌液浓度OD600=0.5、侵染时间10-12 min、共培养2-3 d可以显著提高转化率。对具有潮霉素抗性的小芽进行了分子检测,潮霉素片段PCR和R-Fom-2基因RT -PCR检测证明R- F om-2基因己经整合到甜瓜基因组DNA中并得到表达。本实验中转化频率为3%左右,实验中生根频率达85%以上。采用离体叶片接种法对转基因甜瓜进行生理抗性初步检测,结果表明,转基因甜瓜与对照植株相比,对枯萎病的抗性均有不同程度的增强。进一步证明了R-Fom-2基因可能为新疆甜瓜抗枯萎病的一个功能基因。本研究利用根癌农杆菌介导法将R-Fom-2基因转化新疆感病甜瓜品种皇后,获得了转基因再生植株,并进行基因转录表达的初步检测和抗病功能检测,为探索甜瓜抗枯萎病的分子机制奠定了基础,为R-Fom-2基因的抗性相关性研究及应用提供了实验依据,也为利用其他抗性基因进行新疆甜瓜抗病分子育种提供参考价值。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1、植物抗病基因
  • 1.1 两种主要的植物抗病遗传基础模式:配体-受体模型和防卫（Guard）模型
  • 1.2 已克隆抗病基因的结构与功能
  • 1.3 植物抗病基因的潜能开发与应用
  • 2、甜瓜抗病基因研究进展
  • 2.1 甜瓜抗病基因
  • 2.2 甜瓜遗传转化研究
  • 3、本研究的目的和意义
  • 第一章 R-Fom-2基因的亚克隆与植物表达载体构建
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 植物材料、菌种与质粒
  • 1.1.2 试剂
  • 1.1.3 主要仪器
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 碱裂解法提取质粒pMD18-T/R-Fom-2
  • 1.2.2 PCR 扩增R-Fom-2 基因
  • 1.2.3 PCR 反应产物的回收
  • 1.2.4 目的基因R-Fom-2 的亚克隆
  • 1.2.5 重组子pMD18-T/R-Fom-2-2 的筛选
  • 1.2.6 植物表达载体pCA-Fom-2 的构建
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 重组质粒pMD18-T/R-Fom-2-2 的PCR 鉴定
  • 2.2 重组质粒pMD18-T/R-Fom-2-2 的酶切鉴定
  • 2.3 植物表达载体质粒pCA-Fom-2 的初步鉴定
  • 2.4 植物表达载体质粒pCA-Fom-2 的PCR 鉴定
  • 2.5 植物表达载体质粒pCA-Fom-2 的酶切鉴定
  • 3. 讨论
  • 第二章 甜瓜组织再生体系的的建立
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料与试剂
  • 1.1.1 植物材料
  • 1.1.2 试剂
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 甜瓜无菌苗的获得
  • 1.2.2 培养环境
  • 1.2.3 甜瓜直接出芽培养基的选择
  • 1.2.4 甜瓜外植体的选择
  • 1.2.5 继代培养
  • 1.2.6 生根培养
  • 2 结果与分析
  • 2.1 直接出芽培养基的选择
  • 2.2 甜瓜再生体系中外植体的确定
  • 2.3 丛生芽生根
  • 2.4 试管苗的移栽
  • 3 讨论
  • 第三章 根癌农杆菌介导R-Fom-2 基因转化甜瓜及其检测分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 植物材料与菌种
  • 1.1.2 试剂
  • 1.1.3 培养基
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 根癌农杆菌的转化及鉴定
  • 1.2.2 抑菌抗生素羧苄青霉素Carb 浓度的确定
  • 1.2.3 Hyg 选择压力的确定
  • 1.2.4 甜瓜的转化
  • 1.2.5 转基因甜瓜植株的分子检测
  • 1.2.6 转基因甜瓜离体叶片抗病性检测分析
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 农杆菌转化子的PCR 鉴定
  • 2.2 羧苄青霉素（Carb）浓度的确定
  • 2.3 Hyg 选择压力的确定
  • 2.4 预培养时间对甜瓜遗传转化的影响
  • 2.5 共培养时间对甜瓜遗传转化的影响
  • 2.6 转基因甜瓜潮霉素基因部分片断的PCR 鉴定
  • 2.7 转基因甜瓜R-Fom-2 的RT-PCR 鉴定
  • 2.8 转基因甜瓜离体叶片抗病性分析
  • 结论
  • 参考文献
  • 附图
  • 英文缩略语
  • 在读期间发表论文清单
  • 致谢

    • 相关论文文献

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    • [2].新疆甜瓜贮藏保鲜现状与对策[J]. 现代农业科技 2015(13)
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    • [19].基于随机前沿分析的新疆甜瓜生产技术效率及其影响因素研究[J]. 北方园艺 2015(20)

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