礁膜（Monostroma nitidum）多糖的提取分离、结构和抗凝血活性研究

论文摘要

礁膜（Monostroma nitidum）隶属于绿藻门,绿藻纲,礁膜科,礁膜属。多糖是其主要的生物活性物质。本文以礁膜为原料,对礁膜多糖进行提取、分离纯化,研究其理化性质、结构和抗凝血活性。礁膜藻体粉末依次经冷水、热水、稀碱和浓碱液提取,得到五种粗多糖CW、HW1、HW2、AM1和AM2,提取得率分别是9.1%、30.6%、5.3%、5.5%和3.7%,总提取率达54.2%。采用苯酚-硫酸法、硫酸钡明胶比浊法、薄层层析、气相色谱、高效液相色谱等方法对其中三种水提取粗多糖CW、HW1和HW2的理化性质和单糖组成进行了比较分析。结果表明:总糖含量HW2最高,CW最低;蛋白含量以CW最高,HW1最低;硫酸基含量以HW1最高,CW最低。三种粗多糖的单糖组成均以鼠李糖为主,含有少量葡萄糖和木糖,CW含有微量甘露糖,HW1含有微量的半乳糖和甘露糖;糖醛酸的类型均为葡萄糖醛酸。在对粗多糖理化性质和单糖组成测定的基础上,选取HW1作为研究对象,采用离子交换色谱和凝胶排阻色谱相结合对其进行分离纯化得到两种纯化多糖WF1和WF3。采用高效液相色谱法、气相色谱法、红外光谱法对两种多糖的重均分子量、纯度及单糖组成进行研究。结果表明:多糖WF1和WF3经SB-804HQ柱洗脱呈单一对称峰,表明两种多糖的纯度较高,重均分子量分别是870 kD和70 kD,WF1的分子量明显大于WF3;两种多糖的单糖组成均以鼠李糖为主,含有少量木糖和葡萄糖,另外,WF1含有微量半乳糖,WF3含有微量甘露糖;糖醛酸类型是葡萄糖醛酸。红外光谱图在1250 cm-1左右有S=O的伸缩振动吸收峰,表明了两种多糖均是带有硫酸基的鼠李聚糖。采用脱硫酸基反应、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应、气相色谱、高效液相色谱、红外光谱、核磁共振波谱和气质联用等方法对多糖WF1和WF3的结构进行研究。结果表明:WF1的糖链中是以1, 2-Rha为主,含有有1, 4和1, 3-Rha,硫酸基的位置以C-3、C-4较多,C-2位相对较少,也可能C-3、C-4和C-2均带有硫酸基。WF3的糖链中是以1, 3-Rha为主,含有1, 2-Rha,存在1→2,3连接的Rha分支点,硫酸基的位置以C-4位较多,C-2、C-3位相对较少,也可能C-3、C-4和C-2均带有硫酸基。脱硫前后的红外谱图对比解析表明两种多糖的构型为α型。核磁共振谱图进一步说明WF3是α构型,C-3位是糖链的连接位点,C-2位、C-4位可能有硫酸基取代。通过活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT）分析,对礁膜多糖WF1和WF3的抗凝血活性进行研究。结果表明:WF1和WF3对APTT和TT均有延长作用,但对PT作用不明显,说明WF1和WF3主要抑制内源性凝血途径和/或共有凝血途径以及抑制凝血酶活性或纤维蛋白原转化为纤维蛋白,而对外源性凝血途径没有影响。而且,WF1抗凝血活性明显高于WF3,这主要是由于它们的分子量、硫酸基含量和结构的差异所引起的。WF1和WF3的抗凝血活性比肝素低。本研究提取、分离纯化得到两种礁膜多糖WF1和WF3,关于这两种多糖的结构到目前为止国内外尚未见研究报道。本课题为礁膜多糖的研究提供更多的基础资料,为进一步研究其结构与活性的关系奠定了基础,对促进“海洋糖库”的建设,发展具有我国特色的海洋新药都有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 海藻多糖的生物学活性
• 1.1 抗凝血活性
• 1.2 免疫调节作用
• 1.3 抗氧化活性
• 1.4 抗病毒作用
• 2 多糖的结构研究
• 2.1 多糖的一级结构研究
• 2.1.1 化学方法
• 2.1.2 仪器分析方法
• 2.1.3 生物学方法
• 2.2 多糖高级结构的测定
• 3 绿藻多糖研究进展
• 3.1 木糖-阿拉伯糖-半乳糖聚合物
• 3.2 葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物
• 4 硫酸化多糖的结构与生物活性的关系
• 4.1 多糖的单糖组成及糖苷键类型
• 4.2 分子量
• 4.3 硫酸基及其取代度
• 4.4 硫酸基的取代位置
• 5 本研究立题背景及研究意义
• 第二章 礁膜多糖的提取及理化性质研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 实验原料
• 1.2 主要实验试剂和色谱材料
• 1.3 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 礁膜粗多糖的提取
• 2.2 理化性质分析
• 2.2.1 总糖含量的测定
• 2.2.2 蛋白质含量测定
• 2.2.3 硫酸基含量测定
• 2.2.4 糖醛酸含量测定
• 2.3 多糖的单糖组成分析
• 2.3.1 TLC 分析法
• 2.3.2 高效液相色谱法
• 2.3.3 气相色谱法
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 礁膜粗多糖的提取
• 3.2 理化性质分析
• 3.2.1 总糖含量的测定
• 3.2.2 蛋白质含量的测定
• 3.2.3 硫酸基含量的测定
• 3.2.4 糖醛酸含量的测定
• 3.3 单糖组成分析
• 3.3.1 薄层层析法
• 3.3.2 高效液相色谱法
• 3.3.3 气相色谱法
• 第三章 礁膜多糖HW1 的分离纯化与理化性质研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂及色谱材料
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 礁膜多糖HW1 的分离纯化
• 2.1.1 离子交换色谱分离
• 2.1.2 凝胶渗透色谱分离
• 2.2 单糖组成分析
• 2.3 理化性质分析
• 2.4 纯度分析和分子量测定
• 2.5 旋光度的测定
• 2.6 红外光谱分析
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 多糖的分离与纯化
• 3.1.1 离子交换色谱分离
• 3.1.2 凝胶排阻色谱纯化
• 3.2 理化性质分析
• 3.3 单糖组成分析
• 3.4 纯度分析和分子量测定
• 3.5 旋光度的测定
• 3.6 红外光谱分析
• 第四章 礁膜多糖WF1 和WF3 的结构研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂及材料
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 脱硫酸基反应
• 2.1.1 实验试剂处理
• 2.1.2 多糖吡啶盐的制备
• 2.1.3 脱硫酸基反应
• 2.2 高碘酸氧化和 Smith 降解
• 2.2.1 高碘酸氧化
• 2.2.2 Smith 降解
• 2.2.3 高效液相分析
• 2.3 甲基化反应
• 2.3.1 试剂处理
• 2.3.2 多糖的甲基化反应
• 2.3.3 GC/MS 分析
• 2.4 核磁共振波谱分析
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 脱硫酸基反应
• 3.2 高碘酸氧化和 Smith 降解
• 3.2.1 高碘酸的消耗量与甲酸的生成量
• 3.2.2 高效液相色谱法分析高碘酸氧化和 Smith 降解产物
• 3.3 甲基化分析
• 3.3.1 甲基化程度的确定
• 3.3.2 气质分析
• 3.4 核磁共振波谱
• 第五章 礁膜多糖WF1 和WF3 的抗凝血活性研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 血浆的分离
• 2.2 活化部分凝血活酶时间（APTT）检测方法
• 2.3 凝血酶原时间（PT）检测方法
• 2.4 凝血酶时间（TT）检测方法
• 3 实验结果与讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢