论文摘要
研究背景肿瘤是细胞分化、增殖和死亡机制发生异常的结果。DNA的损伤和基因结构的异常，以及由此造成的所谓癌基因和／或抑癌基因的表达和功能上的改变，是细胞恶性转化的前提。但并不是所有的损伤均导致基因突变，其原因就在于细胞内的DNA修复系统能够清除和修复DNA损伤。其中，碱基切除修复（BER）是清除细胞内DNA损伤的主要途径，而DNA聚合酶β（DNA polymeraseβ，DNA polβ）又是BER过程的关键酶。DNA聚合酶β广泛分布于哺乳类细胞中，是真核细胞主要的DNA损伤修复基因，其DNA序列高度保守，为一看家基因。其表达水平在整个细胞周期中相对稳定且不受细胞周期增殖调控。正常细胞DNA聚合酶β是低水平表达的。近年来许多研究者在人类肿瘤组织标本中发现DNA聚合酶β基因的突变，如结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌和食管癌。此外，近来发现在很多的肿瘤中polβ在基因和蛋白质水平存在高水平的表达，在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和食管癌中发现polβ的表达量比癌旁正常组织高数倍到数十倍。高表达的polβ通过DNA修复途径、跨损伤合成和DNA复制等机制在核苷酸水平上增加了核苷酸的突变率，导致细胞的自发突变增加，促使了肿瘤的发生发展。研究结果已经证实polβ突变和高表达与多种肿瘤的发生发展有密切关系。但是，目前关于polβ低表达与肿瘤的发生发展有何关系以及对肿瘤细胞的生物学特性有何影响的研究报道尚不多。RNAi技术的出现就为探求这一问题提供了一个新的方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA（doublestrands RNA，dsRNA）引起的保守的生物学反应，dsRNA经过RNA酶Ⅲ核酸酶（Dicer）处理后，降解成21-23个碱基的siRNA（small interfering RNA），siRNA与RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合后，siRNA解链，反义链引导RNA诱导沉默复合物与同源mRNA结合，从而切割mRNA，使之丧失转录信息，达到特异性抑制目的基因表达的效果。研究目的本实验通过构建DNA polβ靶向的siRNA表达载体，将siRNA表达载体和野生型polβ转染至食管癌EC9706细胞，调控polβ的表达状态。对食管癌EC9706细胞在DNA polβ不同表达水平下的生物学特性进行了探讨。旨在揭示DNA polβ基因在细胞内的适宜表达和功能状态，为食管癌的干预防治提供新的思路及治疗的靶点。研究方法根据GenBank报道的DNA聚合酶β的核苷酸序列（M13140），参照siRNA的设计策略，选取了RNAi的位点，设计合成针对其编码区的DNA寡核苷酸单链，退火后形成双链。与携带hU6启动子的pSINsi-hU6质粒构建针对DNA聚合酶β的siRNA表达载体。在阳离子脂质体的介导下，将siRNA表达载体和野生型polβ转染至食管癌EC9706细胞株。实验分为五组，分别为转染siRNA表达载体的实验组1和实验组2、转染野生型polβ的polβ高表达组、转染空载体pSINsi-hU6的空载体组和未转染的空白对照组，G418筛选阳性克隆后建立稳定表达的细胞系。通过流式细胞术观察DNA polβ不同表达水平下食管癌EC9706细胞体外生长和增殖的改变；接种裸鼠后，通过荧光定量PCR方法检测裸鼠体内肿瘤组织中DNA聚合酶βmRNA的表达，通过裸鼠皮下成瘤实验检测DNA polβ不同表达水平下食管癌细胞致瘤能力的变化来观察其对食管癌EC9706细胞体内增殖的影响。实验结果1．成功构建DNA polβ靶向的siRNA表达载体pSINsi-hU6-siRNApolβ288和pSINsi-hU6-siRNApolβ814。2．siRNA表达载体和野生型polβ脂质体法转染EC9706细胞，经G418筛选获得阳性克隆细胞。3．流式细胞术结果显示转染DNA polβ靶向的siRNA表达载体（pSINsi-hU6-siRNApolβ288和pSINsi-hU6-siRNApolβ814）和野生型polβ的EC9706细胞，与转染空载体和未转染的EC9706细胞相比，细胞周期S期频率显著增加（P＜0.05）。4．裸鼠实验结果显示与空载体组和空白对照组相比，转染DNA polβ靶向的siRNA表达载体（pSINsi-hU6-siRNApolβ288和pSINsi-hU6-siRNApolβ814）的实验组1和实验组2，肿瘤重量显著增加（P＜0.01）；与空载体组和空白对照组相比，转染野生型polβ的DNA polβ高表达组，肿瘤重量亦显著增加（P＜0.01）。实验组1、实验组2和DNA polβ高表达组之间肿瘤重量无明显差异。5．荧光定量PCR检测肿瘤组织中INA polβmRNA的表达。与空载体组和空白对照组相比，转染DNA polβ靶向的siRNA表达载体（pSINsi-hU6-siRNApolβ288和pSINsi-hU6-siRNApolβ814）的实验组1和实验组2中polβmRNA的表达显著下降（P＜0.01），转染野生型polβ的DNA polβ高表达组中polβmRNA的表达显著升高（P＜0.01）。表明构建的siRNA表达载体对DNA polβ有显著的沉默抑制作用，且沉默效果相同。结论研究结果显示，不仅DNA polβ的高表达与食管癌的发生有关，而且DNA polβ的过低表达也可能是食管癌发生的一重要的分子机制。因此，利用RNAi技术抑制polβ到适宜水平的表达，既维持polβ修复酶活性又不会产生因其高表达而导致的低保真复制，可能会对食管癌的干预治疗有所帮助。