家族性阿尔茨海默病基因突变筛选及APP表达载体的构建

论文摘要

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年人群常见的渐进性神经退行性疾病。临床及实验研究已确定3种导致早发家族性AD （FAD）的基因,即淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）、早老素-1（presenilin 1, PS-1）和早老素-2（presenilin 2, PS-2）。目前已有AD家系的基因突变数据大都来自国外,国内鲜有报道。为了解国内FAD的致病基因突变情况,本研究对部分中国人群中上述三个基因的突变热点进行检测分析；对于新发突变,进行初步的分子机制研究。方法：收集AD患者及其亲属的外周血样本,提取基因组DNA,针对PS-1和PS-2基因的编码外显子和APP外显子16、17设计引物,PCR扩增基因外显子后测序筛选相关基因突变。对于检测到的新发突变,采用Megaprimer-PCR法构建相应基因的cDNA突变体和真核表达质粒载体,经脂质体法转染HEK293细胞,G418筛选稳定表达细胞株；为在神经细胞中高效表达和研究FAD突变体的致病机理,本研究构建了重组腺病毒穿梭质粒,Pme I线性化后转化AdEasier（含有pAdEasy-1质粒的BJ5183）感受态细胞构建重组腺病毒质粒,经Pac I酶切乙醇沉淀后脂质体法转染HEK293细胞包装重组腺病毒,并用Western Blot进行鉴定。结果：AD临床样本致病基因的测序结果显示本研究筛选到一个PS-1基因的突变（R278I）和一个APP基因的新突变（K724X）。构建的APP695野生型及突变型真核表达质粒pcDNA3.1（-）-APP695WT、pcDNA3.1（-）-APP695K724X和pcDNA3.1 （-）-APP695K724N经过了菌液PCR和测序鉴定,获得了相应的HEK293稳定表达细胞株。构建的重组腺病毒质粒pAd-APP695WT、pAd-APP695K724X和pAd-APP695K724N,经过了菌液PCR和测序鉴定,Western Blot鉴定结果显示重组腺病毒包装成功。结论：本研究筛选到一个PS-1基因的突变（R278I）和一个新的导致FAD的APP基因突变（K724X）；构建了APP695相应的真核表达载体,建立了稳定表达HEK293细胞株；构建并成功包装了重组腺病毒,为深入研究FAD的发病机制和药物筛选奠定基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 国内外研究现状
• 1.3 实验设计和流程
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒载体
• 2.1.2 细菌菌株
• 2.1.3 细胞株
• 2.1.4 主要工具酶及试剂
• 2.1.5 主要试剂盒及耗材
• 2.1.6 主要试剂的配制
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 AD外周血样本的收集及基因组DNA的提取
• 2.2.2 PS-1、PS-2和APP各外显子扩增引物的设计合成
• 2.2.3 基因突变的筛选
• 2.2.4 APP695真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的建立
• 2.2.5 APP腺病毒表达载体pAd-APP695X的构建及腺病毒包装
• 3 结果
• 3.1 AD外周血样本的收集情况
• 3.2 PS-1,PS-2编码外显子及APP外显子16、17的扩增结果
• 3.3 基因突变筛选的部分测序结果
• 3.4 pcDNA3.1（-）-APP695X的构建及稳定表达细胞株的建立
• 3.4.1 APP695WT基因片段的PCR扩增
• 3.4.2 APP695突变基因片段（APP695mutation）的PCR扩增
• 3.4.3 pcDNA3.1（-）-APP695X的菌液PCR鉴定
• 3.4.4 稳定表达多克隆细胞株的建立
• 3.5 pAd-APP695X的构建及腺病毒Ad-APP695X的包装
• 3.5.1 穿梭质粒pShuttleCMV-APP695X的构建
• 3.5.2 重组腺病毒质粒pAd-APP695X的构建
• 3.5.3 腺病毒Ad-APP695X的包装
• 3.5.4 腺病毒Ad-APP695X的鉴定
• 3.5.5 腺病毒Ad-APP695X的滴度测定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录A
• 作者简历
• 学位论文数据集