稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG4表达模式与功能分析

论文摘要

细胞自噬是真核生物中高度保守的过程,在此过程中,包括过剩或异常的细胞器在内的细胞物质被包裹进双层膜的自噬泡中并被运输到溶酶体或液泡中进行降解,从而使得生物大分子得以重新利用。细胞自噬在诸如对变化环境的适应、发育与分化过程中细胞形态的建成以及细胞寿命的决定等一系列生物事件中起着重要作用。细胞自噬相关基因最早在酵母中被鉴定,如今在所有的高等生物中已发现其同源基因。细胞自噬可由饥饿诱导产生并维持一个氨基酸库以便合成一些必需的蛋白质。稻瘟病是一种由稻瘟病菌引起的毁灭性病害,给全世界的水稻生产带来巨大威胁。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）具有典型的生活史和侵染循环,且被认为是丝状真菌分子生物学和病原菌与寄主互作研究的模式生物。稻瘟病菌能够形成专门的侵染结构—附着胞,其能够产生巨大的胞内膨压（约8.0Mpa）,这个压力使稻瘟病菌穿透植物叶片表皮并侵染寄主。本研究主要目的是阐明细胞自噬相关基因MgATG4的表达模式,细胞自噬与稻瘟病菌生长、发育和致病性之间的关系以及细胞自噬相关蛋白MgATG4与MgATG8之间的相互作用。获得的主要研究结果如下:从稻瘟病菌成熟附着胞的差减文库中克隆到了细胞自噬相关基因MgATG4,该基因编码一个53.93kDa的半胱氨酸蛋白酶。将稻瘟病菌MgATG4基因,互补到酵母ATG4基因缺失突变体中,能够恢复酵母的细胞自噬过程;对MgATG4进行时间表达模式分析,发现该基因在孢子、附着胞及菌丝中均有表达;细胞定位分析发现MgATG4蛋白在细胞质中均匀表达。通过构建MgATG4基因置换载体,得到MgATG4基因缺失突变体△mgatg4。△mgatg4突变体在CM培养基上的菌落形态发生变化,菌丝稀疏;产孢量显著下降,约为野生型Guy11的1/90;分生孢子的萌发及附着胞形成延迟;附着胞膨压显著下降,在完整的水稻或者大麦叶片上不能形成可见病斑,致病性丧失;在有磨损的大麦叶片上也未能产生病斑;突变子在OMA培养基上与2539菌株交配,能产生子囊壳,但延迟且量极少;基因MgATG4的缺失,使细胞自噬过程中断,液泡和细胞质中无自噬泡的积累。从稻瘟病菌成熟附着胞的差减文库中克隆得到了另一个细胞自噬相关基因MgATG8,该基因编码一个14.4kDa的ATG8蛋白。对MgATG8进行时间表达模式分析,发现该基因在孢子、附着胞及菌丝中均有表达。通过双分子荧光互补技术检测MgATG4与MgATG8在稻瘟病菌细胞发育过程中的相互作用,分别构建BiFC载体ATG4-YFPN、ATG4△-YFPN和YFPC-ATG8共转化稻瘟病菌Guy11菌株并用潮霉素和草胺磷双抗筛选。转化子BY-7经共聚焦显微镜检测结果发现在孢子、营养菌丝、附着胞形成过程及穿透过程中均没有检测到YFP荧光信号,但在饥饿诱导4h后的菌丝中检测到了MgATG4与MgATG8的相互作用。MgATG4蛋白序列中含有6个半胱氨酸残基。通过序列比对分析,发现MgATG4蛋白序列中的Cys206为保守半胱氨酸;分别构建MgATG4、MgATG8蛋白表达载体pPICZα-ATG4和pPICZα-ATG8,并采用定点突变技术将MgATG4第206位的半胱氨酸残基Cysteine突变为丝氨酸Serline。采用毕赤酵母表达系统表达野生型和突变体MgATG4-His融合蛋白以及MgATG8-His融合蛋白并纯化。体外蛋白酶切实验表明Cys206是MgATG4的活性位点。

论文目录

• 致谢
• 缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 稻瘟病与稻瘟病菌
• 1 稻瘟病菌的侵染循环
• 2 稻瘟病菌附着胞形成
• 3 侵染栓的形成和侵入
• 4 稻瘟病菌附着胞形成过程中的相关基因
• 4.1 参与表面识别的基因
• 4.2 黑色素相关基因
• 4.3 产孢相关基因
• 4.4 甘油合成相关基因
• 5 稻瘟病菌信号传导途径
• 5.1 G蛋白耦连的信号途径
• 5.2 环化腺苷酸（cAMP）信号途径
• 5.3 MAPK（mitogen-activated protein kinase）信号传导途径
• 2+离子途径'>5.4 Ca²⁺离子途径
• 5.5 其它致病性相关的基因
• 第二节 细胞自噬的研究进展
• 1 细胞自噬的类型
• 2 细胞自噬的研究方法
• 2.1 形态学方法
• 2.2 细胞自噬的特异标志物
• 2.3 特异抑制剂
• 3 细胞自噬的分子机制
• 3.1 细胞自噬的诱导
• 3.2 自噬体的形成
• 3.3 自噬过程的信号调控
• 第三节 双分子荧光互补技术在研究蛋白质相互作用的应用
• 1 BiFC原理
• 1.1 荧光蛋白的结构与特性
• 1.2 BiFC技术的基本原理
• 2 BiFC技术的基本实验操作
• 3 BiFC的应用
• 3.1 研究转录因子间的相互作用及其亚细胞定位
• 3.2 利用BiFC寻找G蛋白可能存在相互作用的β和γ亚基
• 3.3 检测泛素化途径
• 3.4 利用多色荧光互补技术同时检测多种蛋白质间的相互作用
• 第四节 Pichia酵母系统在蛋白表达中的应用
• 1 常用表达菌株
• 2 巴斯德酵母表达载体
• 3 外源基因的转化和整合
• 3.1 毕赤酵母转化方法
• 3.2 外源基因的整合方式
• 3.3 筛选高拷贝的方法
• 4 外源基因在毕赤酵母中的高效表达
• 4.1 外源基因的性质
• 4.2 培养条件
• 4.3 蛋白酶的降解
• 4.4 表达产物的糖基化
• 4.5 外源蛋白的翻译后修饰
• 第五节 本研究的目的内容及技术路线
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验菌株
• 1.2 质粒载体
• 1.3 文库
• 1.4 供试植物
• 1.5 仪器
• 1.6 试剂
• 1.7 培养基
• 1.7.1 稻瘟病菌培养基
• 1.7.2 大肠杆菌培养基
• 1.7.3 酵母（毕赤酵母）培养基
• 1.7.4 毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
• 2 试验方法
• 2.1 PCR
• 2.1.1 常规PCR
• 2.1.2 LD-PCR（长距离PCR）
• 2.1.3 酵母菌落PCR
• 2.2 DNA操作
• 2.2.1 质粒提取
• 2.2.2 质粒酶切
• 2.2.3 酶切片段的去磷酸化（CIP）
• 2.2.4 琼脂糖电泳
• 2.2.5 DNA片段的凝胶回收
• 2.2.6 连接反应
• 2.3 质粒转化
• 2.3.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.3.2 感受态细胞转化
• 2.3.3 X-gal和IPTG直接用于琼脂平板
• 2.3.4 阳性克隆子的鉴定
• 2.4 稻瘟病菌基因组DNA提取
• 2.4.1 菌丝培养
• 2.4.2 基因组DNA的提取（CTAB法）
• 2.5 稻瘟病菌RNA提取与分析
• 2.6 稻瘟病菌原生质体的制备与转化
• 2.6.1 原生质体的制备
• 2.6.2 稻瘟病菌原生质体的转化（室温或者冰上）
• 2.6.3 溶液及培养基配方
• 2.7 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交
• 2.7.1 DIG-DNA标记
• 2.7.2 基因组DNA的消化、电泳及变性
• 2.7.3 DNA转膜
• 2.7.4 Southern杂交过程
• 2.7.5 免疫显色
• 2.7.6 所需试剂
• 2.8 荧光观察
• 2.9 突变体表性分析
• 2.9.1 生长速率测定
• 2.9.2 产孢量分析
• 2.9.3 孢子发芽率测定
• 2.9.4 孢子附着胞形成率分析
• 2.9.5 附着胞膨压分析
• 2.9.6 有性杂交分析
• 2.9.7 细胞自噬的观察
• 2.10 致病性分析
• 2.10.1 大麦离体接种试验
• 2.10.2 水稻喷雾接种
• 2.10.3 透射电镜样品制备
• 2.11 酵母互补分析
• 2.11.1 酵母感受态的制备与转化
• 2.11.2 酵母菌落PCR
• 2.11.3 酵母MgATG4互补突变体的饥饿诱导
• 2.12 双分子荧光互补分析
• 2.12.1 载体构建
• 2.12.2 原生质体共转化
• 2.13 MgATG4基因的定点突变
• 2.13.1 构建蛋白表达载体
• 2.13.2 引物设计:
• 2.13.3 PCR定点突变:
• 2.13.4 DpnI处理酶切产物:
• 2.13.5 转化酶切产物:
• 2.14 毕赤酵母蛋白表达菌株活化
• 2.14.1 酵母菌株的分离纯化
• 2.14.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F'的活化培养
• 2.15 毕赤酵母表达的试验方法
• 2.15.1 质粒DNA的线性化处理
• 2.15.2 毕赤酵母电转化菌体的准备
• 2.15.3 电击转化
• 2.15.4 确定转化子的Mut表型
• R转化子的PCR验证'>2.15.5 Zeo^R转化子的PCR验证
• +表型重组酵母的诱导表达实验'>2.15.6 Mut⁺表型重组酵母的诱导表达实验
• 2.16 蛋白质电泳（Tricine-SDS-PAGE）及杂交
• 2.16.1 蛋白质电泳及杂交试:
• 2.16.2 凝胶的制备
• 2.16.3 样品准备（TCA沉淀蛋白方法）
• 2.16.4 上样电泳
• 2.16.5 考马斯亮蓝染色与脱色
• 2.16.6 蛋白质杂交
• 2.17 蛋白的大量表达与纯化
• 2.17.1 蛋白的大量表达
• 2.17.2 蛋白浓缩（硫酸铵沉淀法）
• 2.18 蛋白酶切试验
• 第三章 细胞自噬基因MgATG4的表达模式及功能研究
• 1 MgATG4基因的克隆与鉴定
• 1.1 MgATG4基因的PCR扩增结果
• 1.2 重组质粒的酶切验证
• 1.3 测序结果与序列分析
• 2 MgATG4基因与酵母ATG4基因同源性分析
• 3 MgATG4的表达模式分析
• 3.1 MgATG4的时间表达模式
• 3.1.1 通用载体pEGFP-HPH的构建
• 3.1.2 pMgATG4（p）-GFP融合载体的构建
• 3.1.3 MgATG4在孢子、菌丝及附着胞中均有表达
• 3.2 MgATG4基因的空间表达分析
• 3.2.1 MgATG4-GFP融合载体的构建
• 3.2.2 MgATG4蛋白的细胞定位
• 4 MgATG4基因缺失突变体及互补转化子的获得
• 4.1 MgATG4基因敲除载体的构建
• 4.2 Δmgatg4突变体的获得
• 4.3 互补载体的构建
• 4.4 RT-PCR验证
• 5 突变体表型分析
• 5.1 突变体菌落形态
• 5.2 突变体Δmgatg4产孢量明显下降
• 5.3 交配试验
• 5.4 孢子萌发与附着胞形成
• 5.5 附着胞膨压下降
• 5.6 突变体Δmgatg4对饥饿敏感
• 5.7 突变体Δmgatg4的细胞自噬过程中断
• 5.8 突变体Δmgatg4致病性丧失
• 5.8.1 离体接种
• 5.8.2 喷雾接种
• 5.8.3 致病机理研究
• 6 本章小结
• 第四章 利用BiFC检测MgATG4与MgATG8的体内互作研究
• 1 MgATG8基因的克隆与鉴定
• 2 MgATG8基因的时间表达模式
• 2.1 pMgATG8（p）-GFP融合载体的构建
• 2.2 MgATG8在孢子、附着胞及菌丝中均有表达
• 3 BiFC表达载体的构建
• 3.1 MgATG4（p）-ATG4-YFPN表达载体的构建
• 3.2 阴性对照载体的构建
• 3.3 MgATG4（p）-YFPC-ATG8表达载体的构建
• 3.4 表达载体的共转化及转化子筛选
• 3.5 转化子的Southern blot鉴定
• 3.6 YFP荧光的检测
• 4 小结
• 第五章 MgATG4、MgATG8在毕赤酵母中的表达及MgATG4活性位点研究
• 1 MgATG4、MgATG8基因毕赤酵母表达载体的构建
• 1.1 MgATG4和MgATG8基因的克隆
• 1.2 pPICZα-ATG4和pPICZα-ATG8表达载体的构建
• 1.3 pPICZα-ATG4和pPICZα-ATG8表达载体的酶切验证
• 2 MgATG4基因半胱氨酸位点的突变
• 2.1 MgATG4保守半胱氨酸的确定
• 2.2 定点突变引物的设计
• 2.3 基因定点突变反应
• 2.4 基因点突变鉴定
• 2.5 突变测序结果
• 3 MgATG4、MgATG8在毕赤酵母中的分泌表达
• 3.1 毕赤酵母转化子的筛选
• 3.1.1 MMH和MDH培养基筛选
• 3.1.2 PCR验证
• 3.2 MgATG4和MgATG8在毕赤酵母中的分泌表达和鉴定
• 3.2.1 表达上清电泳及Weastern blot检测
• 3.2.2 表达蛋白的分析
• 3.3 融合蛋白的大量表达及纯化
• 3.4 MgATG4半胱氨酸活性位点的确定
• 4 本章小结
• 第六章 全文讨论及后续研究展望
• 1 全文讨论
• 1.1 细胞自噬相关基因启动子的表达调控
• 1.2 细胞自噬过程是进化上高度保守的过程
• 1.3 细胞自噬是真菌发育所必需的过程
• 1.4 细胞自噬是稻瘟病菌致病性所必需的过程
• 1.5 MgATG4与MgATG8在饥饿诱导条件下相互作用增强
• 1.6 MgATG4蛋白活性位点是高度保守的
• 2 本研究的创新点
• 3 后续研究展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1:本研究中所使用的引物
• 附录2:博士期间发表的论文
• 作者简介