论文摘要
急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是临床上常见的急腹症之一,常合并各种并发症,病死率高。引起AP的病因较多。目前,临床和实验研究证明,细胞因子和氧化应激在AP的发生发展中起重要作用。与AP发生发展有关的细胞因子包括白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）等。细胞因子介导的炎症反应在AP的病理生理变化及引起的多脏器功能受损中发挥重要作用。如果应用细胞因子抑制剂阻断细胞因子介导的级联炎症反应,可以减轻胰腺炎的损伤和全身炎症反应。TNF-α是在AP发病后较早出现的促炎细胞因子,在AP发病后短时间内迅速升高。TNF-α可诱导白细胞介素- 6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）产生,并能刺激一氧化氮和氧自由基的生成,可促使白细胞趋化、黏附,还可使血管内皮细胞通透性增加,损伤微循环。己酮可可碱（pentoxifylline, PTX）是甲基黄嘌呤的衍生物,具有改善微循环、抑制血小板聚集的作用,已应用于临床多个领域,尤其被广泛用于治疗脑血管疾病。PTX是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂,能阻断环磷酸腺苷（cAMP）转变为AMP,引起细胞内cAMP浓度升高,从而抑制细胞内多种物质mRNA的表达,如TNF-α、iNOS、IFN-γ、IL-10等。应用PTX可阻断细胞因子的级联反应,进一步抑制氧自由基的生成,可以减轻胰腺炎症反应。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）是细胞内的一种丝/苏氨酸蛋白激酶,在转导细胞外信号入核的过程中发挥重要作用。MAPK有4个亚家族:细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化的蛋白激酶（p38 MAPK）和巨丝裂原活化蛋白激酶1 （BMK1/ERK5）。许多学者已证实,JNK、p38 MAPK在胰腺损伤及炎症反应中发挥重要作用。JNK、p38 MAPK可被脂多糖（LPS）、TNF-α、IL-1等刺激因子激活,活化的JNK、p38 MAPK转移入核,进一步激活核转录因子,从而参与细胞增殖、转化、凋亡等生物学过程。一些文献报道了p38 MAPK和JNK信号转导通路在AP发生发展中的作用机制,通过抑制p38 MAPK和JNK的激活、减少炎症细胞因子的产生而改善AP的病变程度。有研究提出胰腺腺泡细胞的凋亡发生率与AP病变的严重程度成负相关,诱导细胞凋亡可减轻AP的严重程度,但过度诱导凋亡会加重胰腺的损害。那么通过诱导或抑制腺泡细胞的凋亡,就可以调控AP的严重程度。一些研究表明信号转导通路的激活参与了胰腺细胞的凋亡。因此阻断信号转导通路后可抑制炎性因子的表达,使胰腺细胞凋亡发生改变,可能影响AP病程的进展。目的本研究采用3.5%牛磺胆酸钠诱导大鼠AP模型,并给予PTX干预,通过MAPK信号转导通路,观察TNF-α、ICAM-1和胰腺腺泡细胞凋亡的变化,探讨PTX对AP的保护作用及其机制。方法1实验动物模型的制备:选取清洁健康wistar雄性大鼠（120只）,实验前24小时开始禁食,自由饮水。10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔内注射麻醉,上腹正中切口进入腹腔,显露胰胆管,在近肝门处用无创血管夹夹闭胰胆管后,用4号加工钝头头皮静脉针于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管,以0.2ml/min速度注入3.5%牛磺胆酸钠（0.1ml/100g）,推药后用无创血管夹夹住胆胰管入十二指肠处,观察10min,去除血管夹,关腹。2实验动物分组1)假手术组（SO组）:开腹翻动十二指肠并触摸胰腺3次（n=30）。2)急性胰腺炎组（AP组）:3.5%牛磺胆酸钠诱导的AP模型（n=30）。3)生理盐水对照组（AP-NS组）:制造急性胰腺炎模型成功后,腹腔内注射同等剂量的生理盐水（n=30）。4)急性胰腺炎组+己酮可可碱（pentoxifylline, PTX）组（AP- PTX组）:制造急性胰腺炎模型成功后,腹腔内注射PTX（50mg/kg） （n=30）。另选取6只大鼠作为正常组,处死后留取胰腺组织用于检测p-p38 MAPK和p-JNK1的表达。3标本采集:按1h,3h,6h,9h,12h时间点,分别处死大鼠留取血液和胰腺组织,每时间点6只大鼠。4测定指标及方法1)血淀粉酶测定:采用生化自动分析仪测定。2)胰腺炎组织病理学:HE染色,光镜下观察胰腺组织病理变化。3)血清细胞因子测定:采用ELISA方法测定血清TNF-α、ICAM-1的表达。4) p38 MAPK及JNK1活性的测定:采用Western blotting方法测定,分别检测p-JNK1、p-p38 MAPK的表达。5)胰腺细胞凋亡的检测:TUNEL方法检测胰腺细胞的凋亡率。结果1血清淀粉酶水平SO组血清淀粉酶水平在各时间点无显著性变化,均低于其他组（P<0.01）,AP组、AP-NS组及AP-PTX组血清淀粉酶水平随时间的延长而逐渐增高。其中AP-PTX组各时间点血清淀粉酶水平均显著低于AP组和AP-NS组（P<0.01）。2胰腺组织病理学结果SO组各时间点胰腺轻度水肿,光镜下,除了局限间质水肿,胰腺组织结构清晰,腺泡小叶完整、无坏死、间质水肿和炎症细胞浸润。AP-NS组可见血性腹水,胰腺有坏死灶,光镜下可见胰腺间质水肿,小叶间隙增大,残余腺泡肿胀;并可见弥漫性出血坏死和腺泡小叶结构破坏,周围有大量的嗜中性粒细胞及单核细胞等炎症细胞浸润。AP-PTX组腹水减少,光镜下胰腺组织水肿、出血不明显,腺泡细胞变性和腺泡小叶结构破坏程度较轻,炎症细胞浸润减少。3血清TNF-α、ICAM-1含量在SO组,血清TNF-α和ICAM-1水平在各时间点无显著性变化,均低于其他组（P<0.01）;在AP组、AP-NS组及AP-PTX组,血清TNF-α水平在造模后逐渐升高并在6h达到高峰,各组峰值分别为（174.84±7.87）ng/ml、（179.56±6.79）ng/ml和（163.46±7.51）ng/ml。AP组、AP-NS组及AP-PTX组血清ICAM-1水平随时间的延长而逐渐升高。AP-PTX组各时间点TNF-α水平均显著低于AP组和AP-NS组（P<0.05）,除1h外AP-PTX组其他时间点ICAM-1水平显著低于AP组和AP-NS组（P<0.05）。4 p-p38 MAPK和p-JNK1的表达4.1 p-p38 MAPK的表达Western blotting显示,在38kD的位置出现一条杂交带,43kD的位置出现内参照β-actin的特异条带。经光密度测定分析结果:AP组1h p-p38 MAPK的积分光密度值（IOD）显著升高,3h达到峰值（0.9975±0.005）。与SO组的IOD值（0.8933±0.03215）相比,AP组的IOD值升高（0.9803±0.02001, P<0.01）。与AP-NS组IOD值（0.9953±0.0808）相比,AP-PTX组p-p38 MAPK的IOD值明显降低（0.8883±0.01767, P<0.01）。4.2 p-JNK1的表达Western blotting显示,在46kD的位置出现一条杂交带,43kD的位置出现内参照β-actin的特异条带。光密度测定分析结果:AP组1h p-JNK1的IOD值显著升高至峰值（0.9343±0.03151）。与SO组IOD值（0.6467±0.01528）相比,AP组p-JNK1的IOD值升高（0.9100±0.06083, P<0.01）。与AP-NS组IOD值（0.9367±0.02082）相比,AP-PTX组p-JNK1的IOD值降低（0.6267±0.02309, P<0.01）。5胰腺腺泡细胞凋亡在SO组,可见极少量胰腺腺泡细胞凋亡。AP组造模后1h、3h、6h可见胰腺腺泡细胞凋亡,造模后9h、12h可见胰腺腺泡细胞坏死,少量胰腺腺泡细胞凋亡。与AP组、AP-NS组各时间点相比,AP-PTX组胰腺腺泡细胞凋亡增多,凋亡指数增加（P<0.05）。结论1在牛磺胆酸钠诱导的AP大鼠中,血清淀粉酶升高,胰腺组织出现水肿、炎性浸润、腺泡出血坏死等病理学改变。给予PTX治疗后血清淀粉酶降低,胰腺病理学改变明显减轻。2在AP大鼠,血清TNF-α水平随时间的延长逐渐升高并在6h达到高峰;ICAM-1水平也随时间的延长而逐渐升高。在AP-PTX组,TNF-α和ICAM-1水平均显著低于AP组和AP-NS组,提示PTX可明显抑制这两种炎性因子的释放。3 AP大鼠胰腺组织p-p38 MAPK、p-JNK1表达明显升高,表明MAPK信号转导通路在AP的发生发展中发挥作用。PTX可抑制胰腺组织p-p38 MAPK、p-JNK1的表达。4在AP早期即见有较多的胰腺腺泡细胞凋亡,PTX能够诱导细胞凋亡,诱导细胞凋亡可以减轻AP的病变程度。5本研究表明,PTX在AP损伤中有保护作用,这种保护作用可能与抑制MAPK通路（p38 MAPK和JNK1）有关,由于MAPK通路的抑制,减少炎性细胞因子（TNF-α和ICAM-1）的产生,诱导细胞凋亡。
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