PCOS动物模型及PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究

论文摘要

研究目的和意义多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是育龄期妇女的一种常见内分泌紊乱性疾病。在育龄妇女中,PCOS患病率为4～12%,占无排卵性不孕症患者的30～60%。PCOS患者的病因学、病理生理学、临床表现具有复杂的异质性和明显的种族差异性。此外,PCOS患者还较易发生糖尿病、心血管疾病以及子宫内膜癌等远期并发症。可见,PCOS是关乎女性一生的内分泌和代谢紊乱性疾病。但当前关于PCOS的病因学、诊断标准和最佳治疗方案却还存在许多争论和悬而未决的问题,使PCOS成为研究热点,而研究的重中之重则是PCOS病因学的研究。虽然PCOS的病因学还不明确,但基于PCOS患者具有家族遗传性和异质性的特点,强烈提示PCOS是由遗传和环境两方面共同作用产生的。但既往关于PCOS相关候选基因的研究充满矛盾和争议,很少有可重复性的结论,因此至今还没有发现与PCOS确切相关的一个或几个特异基因。而环境因素影响PCOS的发生是通过什么机制介导的也仍然是一个悬而未决的问题。表观遗传学是研究基因产生表型的过程,是一种不通过改变DNA序列而能调节基因表达的分子现象。表观遗传修饰对于哺乳动物的发育非常重要,同时,表观遗传状态可以被环境因素改变,有导致多种疾病发生的可能。最近发现,表观遗传变异导致的特殊表型还会传递给后代。可见,异常的表观遗传学修饰参与了多种疾病的发生和遗传。2005年LaVoie的研究提示表观遗传修饰异常可能在高雄激素导致的PCOS的发生和遗传中发挥了至关重要的作用。PCOS表观遗传学异常假说提供了一个研究PCOS发生和遗传的新思路。最为常见的一种表观遗传学修饰就是DNA甲基化,启动子区域CpG岛的甲基化与基因的转录抑制有关。PCOS典型的病理生理改变主要包括LH水平升高、高胰岛素血症和高雄激素血症,因此本研究拟以促黄体生成激素受体（luteinization hormone receptor,LHR）、胰岛素受体（insulin receptor,INSR）和雄激素受体（androgen receptor,AR）为研究对像,采用动物模型和病例对照的研究形式探讨三种受体基因是否存在异常的DNA甲基化,期望能够打破PCOS遗传学研究的瓶颈,在PCOS发病机制的研究中有所突破。第一部分:DHEA诱导SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究PCOS起病多在青春期月经初潮前后,其病理生理改变与肾上腺功能初现的生理变化惊人相似,而肾上腺初现的典型表现就是脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）和硫酸脱氢表雄酮（dehydroepiandrosteronesulfate,DHEAS）水平显著增高。基于这种理论,我们给幼年雌性大鼠皮下注射DHEA,期望能够建立一种理想的PCOS动物模型,并针对模型研究LHR、INSR和AR基因DNA甲基化状态。研究方法选取23日龄SD雌性大鼠,建模组每日皮下注射DHEA 6mg/100g体重,对照组每日皮下注射等体积油剂。注射20天后观察两组大鼠卵巢形态学（HE染色）、性激素（E2、T、P、FSH、LH）及空腹血糖和胰岛素的变化,并计算HOMA指数以评价胰岛素抵抗状况。建模成功后利用甲基化特异性PCR技术,检测建模组和对照组大鼠LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化状态。结果1.建模组和对照组一般情况的比较建模组大鼠的体重显著低于对照组（P=0.000）;去除体重的影响后,建模组大鼠卵巢的重量略大于对照组,但无显著性差异（P=0.317）。2.建模组卵巢形态学改变建模组大鼠卵巢皮质内卵泡多呈囊性扩张,各级发育期卵泡及黄体少见,颗粒细胞层数减少,卵泡膜细胞、间质细胞增生。3.建模组和对照组血清激素水平及胰岛素抵抗的评估建模组大鼠血清E2、T、FSH、FINS、FBG均显著高于对照组（P均＜0.05）;LH水平较对照组有所升高,但无显著性差异;LH/FSH比值两组间无显著性差异,HOMA指数显著高于对照组（P=0.000）。4.建模组和对照组卵巢LHR、INSR和AR基因的甲基化检测建模组和对照组大鼠卵巢提取的LHR和AR基因经甲基化特异性PCR后均未检出甲基化条带。INSR基因经MSP后检出甲基化条带,甲基化率为73.3%,显著高于对照组（16.7%）（P=0.000）。小结1.利用DHEA成功诱导SD幼年雌性大鼠出现与PCOS患者相似的卵巢病理改变及雄激素升高和胰岛素抵抗等典型内分泌变化,建立了一种较为理想的PCOS动物模型。2.利用甲基化特异性PCR检测技术发现建模组大鼠LHR、AR基因的甲基化状态与对照组相似,INSR基因的甲基化率显著高于对照组,说明AR、LHR基因并没有发生DNA甲基化介导的转录抑制,INSR基因则发生了DNA甲基化介导的转录抑制,提示胰岛素抵抗、高胰岛素血症可能是肾上腺源性雄激素诱发PCOS的重要原因。3.此模型大鼠胰岛素水平和HOMA指数显著高于对照组,同时利用甲基化特异性PCR检测技术发现建模组大鼠INSR基因的甲基化率显著高于对照组,提示DNA甲基化介导的胰岛素受体基因转录抑制是导致PCOS胰岛素抵抗的发生机制之一。既往研究认为,胰岛素受体后信号传导障碍是PCOS胰岛素抵抗的发生机制,本研究结果却提示,胰岛素受体本身的功能可能因胰岛素受体基因的甲基化而受到影响,这对PCOS胰岛素抵抗的发生机制是一种全新的补充。第二部分:避孕硅胶棒联合hCG诱导SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究LH与高雄激素血症、胰岛素抵抗等PCOS典型病理生理变化均密切相关,是PCOS起病的中间环节。基于这种理论,我们先用左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒抑制HPO轴的功能,抑制排卵,然后给大鼠每日皮下注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）,期望能够建立一个理想的PCOS动物模型,并针对模型研究LHR、INSR和AR基因DNA甲基化状态。研究方法选取24日龄SD雌性大鼠,建模组皮下埋植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒3mm/只,3天后（27日龄）开始皮下注射hCG 1.5 IU 2/日。对照组27日龄始每日皮下注射等体积生理盐水。注射9天后观察两组大鼠卵巢形态学（HE染色）、性激素（E2、T、P、FSH、LH）及空腹血糖和胰岛素的变化,并计算HOMA指数以评价胰岛素抵抗状况。建模成功后利用甲基化特异性PCR技术,检测建模组和对照组大鼠LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化状态。结果1.建模组和对照组一般情况的比较建模组大鼠卵巢重量（P=0.000）和体积（P=0.000）均显著高于对照组。2.建模组卵巢形态学改变建模组大鼠卵巢皮质内卵泡多呈囊性扩张,各级发育期卵泡及黄体少见,颗粒细胞层数减少,卵泡膜细胞、间质细胞增生。3.建模组和对照组血清激素水平及胰岛素抵抗的评估建模组大鼠血清P、T、LH、FINS、FBG水平均显著高于对照组（P均＜0.05）;LH/FSH比值（P=0.000）和HOMA指数（P=0.000）也均显著高于对照组。4.建模组和对照组卵巢LHR、INSR和AR基因的甲基化检测建模组和对照组大鼠卵巢提取的LHR和AR基因经MSP后均未检出甲基化条带;建模组INSR基因经MSP后检出甲基化条带,建模组的甲基化率为76.7%,显著高于对照组（20.0%）（P=0.000）。小结1.利用避孕硅胶棒联合hCG成功诱导SD幼年雌性大鼠出现与P献COS患者相似的卵巢病理改变及LH升高、雄激素升高和胰岛素抵抗等典型内分泌变化,建立了一种较为理想的PCOS动物模型。2.利用甲基化特异性PCR检测技术发现建模组大鼠LHR、AR基因的甲基化状态与对照组相似,INSR基因的甲基化率显著高于对照组,说明AR、LHR基因并没有发生DNA甲基化介导的转录抑制,INSR基因则发生了DNA甲基化介导的转录抑制,提示胰岛素抵抗、高胰岛素血症可能是LH诱发PCOS的重要原因。3.此模型大鼠胰岛素水平和HOMA指数显著高于对照组,同时利用甲基化特异性PCR检测技术发现建模组大鼠INSR基因的甲基化率显著高于对照组,提示DNA甲基化介导的胰岛素受体基因转录抑制是导致PCOS胰岛素抵抗的发生机制之一,这对PCOS胰岛素抵抗的发生机制是一种全新的补充。第三部分PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究1935年Stein和Leventhal首次真正意义上提出PCOS的诊断和治疗方法时,多囊卵巢（polycystic ovary,PCO）就是Stein-Leventhal综合征（S-L综合症）最为重要的临床表现之一。但时至今日,作为PCOS最有特征性和重要性的表现之一,多囊卵巢的发生机制却还存在许多争议和尚未解决的问题。为了进一步研究PCOS患者PCO发生机制,我们从表观遗传学的角度出发,探讨LHR、INSR、AR基因DNA甲基化在PCOS患者PCO发生中的作用。研究方法研究对像均为盆腔输卵管因素的继发不孕患者,年龄25～34岁,BMI18.5～22.9,排除子宫内膜异位症,基础性激素水平、空腹血糖和空腹胰岛素水平均正常,均为长周期降调节超促排卵方案且为首个IVF-ET治疗周期。PCOS的诊断依照2003年的鹿特丹标准,但入选的患者均为稀发排卵或无排卵同时具有多囊卵巢的患者,并无高雄激素的临床表现和/或高雄激素血症。满足入选条件并诊断为PCOS的患者归入PCOS组;满足入选条件的卵巢正常反应患者归入对照组。在取卵日获取两组患者的卵泡液,用percoll梯度离心法分离出黄素化颗粒细胞,利用甲基化特异性PCR技术检测PCOS不孕患者和对照组患者黄素化颗粒细胞LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化状态。结果1.PCOS组和对照组一般情况的比较最后参与本项研究的共有69例不孕患者,其中PCOS组39例,对照组30例。两组患者的年龄、BMI、月经第3天基础激素值（E2、T、P、FSH、LH）、空腹血糖和空腹胰岛素均无显著性差异,LH/FSH比值和HOMA指数亦无显著性差异。2.LHR、INSR和AR基因的甲基化检测PCOS组和对照组卵巢黄素化颗粒细胞提取的LHR、AR和INSR基因经甲基化特异性PCR后,均未检出完全化甲基化状态的特征条带,仅部分标本检测出半甲基化状态的特征条带。比较了PCOS组和对照组三条基因的半甲基化状态发生率,未见统计学差异（P均＞0.05）。小结本部分研究利用甲基化特异性PCR检测技术发现非雄激素增高的PCOS患者和对照组患者LHR、INSR和AR基因的甲基化状态无显著差异,提示PCOS患者出现卵巢PCO的改变目前还不能证实是通过LHR、AR和INSR基因的甲基化模式改变导致的,PCOS患者卵巢PCO改变的发生机制需要进一步研究。全文小结1.本研究模拟肾上腺源性雄激素增高和LH水平增高均诱导SD幼年雌性大鼠出现了与PCOS患者相似的卵巢病理改变和内分泌代谢变化,成功建立了两种PCOS动物模型。2.利用甲基化特异性PCR检测技术发现建模组大鼠LHR、AR基因的甲基化状态与对照组相似,INSR基因的甲基化率则显著高于对照组,说明AR、LHR基因并没有发生DNA甲基化介导的转录抑制,INSR基因则发生了DNA甲基化介导的转录抑制,提示胰岛素抵抗、高胰岛素血症可能是肾上腺源性雄激素和LH诱发PCOS的重要原因。3.两种PCOS模型大鼠的胰岛素水平和HOMA指数均显著高于对照组,同时利用甲基化特异性PCR检测技术发现建模组大鼠INSR基因的甲基化率显著高于对照组,提示DNA甲基化介导的胰岛素受体基因转录抑制是导致PCOS胰岛素抵抗的发生机制之一。既往研究认为,胰岛素受体后的信号传导障碍是PCOS胰岛素抵抗的发生机制,本研究结果却提示,胰岛素受体本身的功能可能因胰岛素受体基因的甲基化而受到影响,这对PCOS胰岛素抵抗的发生机制是一种全新的补充。4.本研究利用甲基化特异性PCR检测技术发现非雄激素增高的PCOS不孕患者和对照组不孕患者LHR、INSR和AR基因的甲基化状态无显著差异,提示PCOS患者出现卵巢PCO的改变目前还不能证实是通过LHR、INSR和AR基因的甲基化模式改变导致的,PCOS患者卵巢PCO改变的发生机制需要进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 前言
• 一、PCOS的病因学研究进展
• 二、表观遗传学概述
• 三、表观遗传学与PCOS的发生
• 四、开展本研究的目的和意义
• 2. 第一部分 DHEA诱导SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 3. 第二部分 避孕硅胶棒联合hCG诱导SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 4. 第三部分 PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 5. 全文小结
• 6. 参考文献
• 7. 缩略语一览表
• 8. 综述
• 9. 攻读学位期间发表论文
• 10. 致谢