杂交瘤细胞分泌的uPA抗体对小鼠精子功能的影响

论文摘要

第一部分uPA抗体阳性杂交瘤细胞上清的制备目的制备可分泌uPA抗体的杂交瘤细胞,并获得含高效价uPA抗体的细胞上清。方法取6～8周龄健康BABL/C小鼠,按单克隆抗体制备技术常规免疫后取尾静脉血,利用间接ELISA检测效价,选择高效价的小鼠,加强免疫后3天取脾脏制备细胞悬液,与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经HAT培养基筛选后待杂交瘤细胞克隆长至孔底面积的2/3时,取细胞上清分三个稀释度（原液、稀释2.5倍、5倍、10倍）检测效价。结果常规免疫后的小鼠血清效价为1:12800,取脾细胞与SP2/0融合后第7天,镜下既可观察得到杂交瘤细胞呈克隆生长,第10天可见到克隆细胞团。取杂交瘤细胞上清检测效价为1:6400,抗体类型为IgG型,其中196个培养孔中有140个是阳性孔,其融合率为71.4%,杂交瘤细胞染色体数目为94±10,为亲代细胞染色体数之和。结论通过常规免疫可得到高效价的IgG抗体,经细胞融合可获得持续分泌uPA抗体的杂交瘤细胞。第二部分uPA抗体阳性克隆的细胞上清对小鼠精子功能的影响实验一uPA抗体阳性克隆细胞的上清对小鼠精子活力和活率的影响目的观察不同稀释度的含有uPA抗体的杂交瘤细胞上清,对小鼠精子不同时间点的活力和活率的影响。方法取成年雄性小鼠的精子,待上游后,按处理因素不同分4组,A、C组:为阳性对照组,A组稀释度为1:5,C组稀释度为1:10;B、D组为阴性对照组,B组稀释度为1:5,D组稀释度为1:10。分别取处理后10min、20min、30min、40min、50min、60min的精子,在显微镜下计数精子活力和活率。活率计数用伊红Y染色法。对不同稀释度、相同时间点的精子活力和活率进行比较,P<0.05为显著性差异。结果在细胞上清稀释5倍时,A组精子的活力在30、40、50、60min与B组比较均有降低（P<0.05）,尤其是50min的精子活力（41±4.3）明显低于B组的精子活力（65±6.7）,P<0.01;A组的精子活率虽然从30min起就开始降低,但50min时的活率（47±4.2）降低最为显著,与B组的活率（69.3±5.2）比较有统计学意义（P<0.01）。在细胞上清稀释10倍时,C组精子活力从30min起开始下降,此后持续一段时间,在60min的活力（45.3±7.9）与D组同时间点的活力（67±6.1）相比,有显著性差异,P<0.01;而C组精子的活率在40min、50min、60min时与D组比较降低有显著性差异（P<0.05）,尤其是在60min时的活率（50.5±5.2）明显低于D组的活率（68.3±4.1）,P<0.01。虽然A组与C组相比,A组的活力和活率在相同时间点降低的幅度比C组大,但这种差别没有统计学意义。结论杂交瘤细胞所分泌的的含uPA抗体的细胞上清可在体外明显地抑制uPA对精子活力和活率的增加,而且这种抑制是可持续的,细胞上清稀释度的不同,小鼠精子活力和活率降低的幅度不同。提示uPA抗体抗体浓度的不同对小鼠精子功能的抑制也不同。实验二uPA抗体阳性克隆细胞的上清对小鼠体外受精的影响目的观察含uPA抗体的细胞上清对小鼠精子的受精能力的影响。方法雄性昆明小鼠,处死取精子,待上游后,按处理因素的不同,分为3组,空白组:IVF-30,阳性对照组:抗体阳性细胞上清加IVF-30,阴性对照组:抗体阴性细胞上清加IVF-30。雌性小鼠促排卵后取卵母细胞团,分组同精子;取处理后60min的三组精子分别作用于三组卵母细胞团,使其受精,最终共有8个组,A组为精、卵空白组与抗体阳性细胞上清,B组为精、卵空白组与抗体阴性细胞上清,C组为卵空白组与精子阳性对照组,D组为卵空白组与精子阴性对照组,E组为精、卵阳性对照组,F组为卵阳性对照组与精子阴性对照组,G组为卵阴性对照组与精子阳性对照组,H组为卵阴性对照组和精子阴性对照组。受精24h后,以卵母细胞内出现雌、雄双原核或者卵周隙有明确的第一、第二极体的出现为判断标准,观察其受精率。用χ2检验进行统计处理,P<0.05为显著性差异。结果A组受精率为39.1%,B组的受精率（65.8%）经χ2检验比较两组受精率有显著性差异（P<0.05）;C组的受精率为35.6%与D组（46.4%）相比,χ2检验有显著性差异（P<0.05）;与F组的受精率（37.6%）相比,E组的受精率（19.6%）降低,经χ2检验比较,有显著性差异（P<0.05）;G组与H组相比,H组的受精率为58.5%而G组的受精率仅为36.2%,经χ2检验比较,有显著性差异（P<0.05）。结论含uPA抗体的细胞上清可明显抑制uPA的作用,降低小鼠精子受精的能力。其可能机制是:该细胞上清一方面降低精子的活力和活率,使到达卵子周围的精子数目减少,另一方面通过抑制卵母细胞团uPA对精子的趋化诱导作用,阻碍精卵接触前的通讯交流,从而最终使得精子受精能力降低。提示:uPA可能是影响精子受精的一个重要因子,uPA抗体可降低精子的受精能力,有望成为抗生育避孕制剂的可能。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 uPA 抗体阳性杂交瘤细胞上清的制备
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 uPA 抗体阳性克隆细胞上清对小鼠精子功能的影响
• 实验一 uPA 抗体阳性克隆细胞上清对小鼠精子活力和活率的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验二 uPA 抗体阳性克隆细胞上清对小鼠体外受精的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢