运用单细胞双重巢式PCR和MDA技术方法行性连锁遗传病诊断

论文摘要

目的1.运用单细胞双重巢式聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction ,PCR）技术在单细胞水平建立一种简便、快速、高准确性的胎儿性连锁遗传疾病诊断方法,为无创性产前诊断性连锁遗传病和植入前遗传学诊断（pre-implantation genetic diagnosis,PGD）提供一定的理论与方法学依据,同时为在本中心建立单细胞PCR技术平台做准备;2.建立单细胞全基因组扩增技术之一多重置换扩增（multiple displacement amplification ,MDA）,扩增单细胞的全部基因组DNA,增加模板量以弥补单细胞模板量少、只能用于一次性检测的不足,为开展单基因病的植入前遗传学诊断（pre-implantation genetic diagnosis,PGD）奠定基础。方法1.提取男女单个淋巴细胞各150例,共300个细胞。随机分成3组,每组男女细胞各50个,双重巢式PCR技术在单细胞水平同时扩增X-类固醇硫酸脂酶基因（steroid sulfatase gene, STS）/Y-假基因和牙釉质基因（Amelogenin,AMEL）,对照组用单重巢式PCR技术在单细胞水平分别扩增两基因,比较单、双重巢式PCR技术在单细胞水平的扩增率及性别诊断正确率。2、应用MDA扩增5个单个淋巴细胞和10个单个卵裂球全基因组DNA,1%的琼脂糖电泳检测扩增效率,通过普通PCR即上述巢式PCR的第二轮的PCR条件检测细胞性别来判断扩增产物的均一性。结果1、单重巢式PCR扩增男性细胞STS和AMEL的扩增率和细胞性别诊断的正确率分别是84%、76%和84%、84%;而双重巢式PCR技术同时扩增上述基因的扩增率和性别诊断正确率分别为98%、96%。后者与前两者相比扩增率和性别诊断正确率均明显提高,差异均有统计学意义（P<0.05、P<0.01）。2、MDA扩增5个淋巴细胞（3个为男性细胞,2个为女性细胞）全部扩增成功,扩增率100%;MDA扩增10个卵裂球有4个扩出产物,扩增率为40%。以MDA产物为模板,用STS的第二轮引物检测单个淋巴细胞性别,正确性为100%;检测所有扩出产物的卵裂球也均能检测出性别,发现2个为男性,2个为女性,可惜的是这4个卵裂球均来自不同的胚胎,所以不能相互验证。从淋巴细胞MDA产物检测的结果可以判断MDA产物也是均一的。结论1、在单细胞水平性连锁遗传疾病诊断中,双重巢式PCR技术较单重巢式PCR技术具有较高的扩增率及诊断正确率,并有助于发现等位基因脱扣（allele dropout, ADO）。该法在无创性单基因伴性遗传病的产前诊断和植入前遗传学诊断中具有较高的实际应用价值,且经济、便捷,值得临床进一步推广。2、初步预实验可知MDA可以克服单细胞的模板量少和不可重复实验的缺点。但由于此次预实验的样本量太小,其稳定性、可靠性还需进一步摸索,才可以用于单基因病的着床前遗传学诊断和产前诊断。

论文目录

• 一 英文缩略词
• 二 中文摘要
• 三 英文摘要
• 四 正文
• 前言
• 第一部分 单细胞双重巢式 PCR 扩增 X、Y 染色体 STS、AMEL 同源序列进行性连锁遗传病诊断
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验内容与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 第二部分 多重置换扩增单细胞全基因组后行性连锁遗传病诊断
• 1 材料
• 2 实验内容与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附图
• 五 附录
• 六 致谢
• 七 综述1
• 八 综述2