河南华溪蟹重组金属硫蛋白的原核表达

论文摘要

金属硫蛋白（Metallothionein, MT）,是一类低分子量、富含半胱氨酸、无芳香族氨基酸、能与金属结合的普遍存在于生物界的非常独特的蛋白质。具有重金属解毒、清除自由基、抗辐射、修复组织损伤、抗衰老以及调节微量元素平衡等重要作用。现有MT主要来自于动物内脏的提取物,存在重金属污染的可能,使之不能成为有效的医药蛋白资源,而其MT蛋白体外原核表达研究也不深入。因此,本论文选用河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）为材料,采用基因重组技术,对其MT在大肠杆菌中的表达进行了较为系统的比较与分析,建立了MT的体外原核表达系统,筛选获得了有效表达MT的菌株,探索了用不同表达载体表达华溪蟹MT。为研究重组MT为抗原制备多克隆抗体,以及在蛋白水平探讨MT的组织分布和细胞定位奠定了基础,为MT在环境监测及环境污染治理方面的应用开辟了途径。首先,在克隆得到河南华溪蟹MT的cDNA,将华溪蟹MTcDNA连接于T载体上得到pGEM-T-MT的基础上,将其导入大肠杆菌DH5α中,以pGEM-T-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pQE31载体,转入大肠杆菌BL21中。结果表明,PCR扩增目的片段产物大小符合要求,重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定与其一致,测序结果正确。其次,在将河南华溪蟹MTcDNA连接于pQE31载体上得到pQE31-MT的基础上,将其导入大肠杆菌DH5α中,以pQE31-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pGEX-6p-1载体,转入大肠杆菌BL21中。结果表明,PCR扩增目的片段产物大小符合要求,重组质粒pGEX-6p1-MT双酶切鉴定与其一致。从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导MT表达的条件,表达出分子量约为35kD的融合蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1 水生动物中重金属的影响
• 2 镉与金属硫蛋白（MT）
• 2.1 镉的理化性质
• 2.2 镉的生物学作用
• 2.3 重金属诱导金属硫蛋白研究进展
• 3 大肠杆菌原核表达系统
• 3.1 原核表达系统
• 3.2 表达载体的类型及研究进展
• 3.3 大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素
• 4 金属硫蛋白的生理功能与研究进展
• 4.1 MT的理化性质和结构特点
• 4.2 MT的生物学功能
• 4.3 MT的分类
• 4.4 MT的应用
• 4.5 MT分子生物学的研究现状及进展
• 5 本文研究的目的、意义和内容
• 第二章 重组表达载体pQE31-MT的构建
• 摘要
• 1 实验材料
• 1.1 菌种及试剂
• 1.2 溶液
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 重组质粒构建流程图
• 2.2 质粒的扩大培养
• 2.3 制备目的基因MT
• 2.4 表达载体和目的片段的连接
• 2.5 重组表达载体的酶切鉴定
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增MT基因片段
• 3.2 pGEM-T-MT的构建
• 3.3 pGEM-T-MT载体双酶切鉴定
• 3.4 pQE31-MT载体的构建
• 3.5 序列测定及分析
• 4 讨论
• Abstract
• 第三章 重组表达载体pGEX-6p1-MT的构建及在大肠杆菌BL21中的表达
• 摘要
• 1 实验材料
• 1.1 菌种与质粒
• 1.2 溶液
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 重组质粒构建流程图
• 2.2 MT基因扩增
• 2.3 MT基因T载体亚克隆和酶切鉴定
• 2.4 pGEX-6p1-MT融合表达载体的构建
• 2.5 含重组MT工程菌株的表达分析及条件优化
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增MT基因片段
• 3.2 连接产物pGEM-T-MT与表达载体pGEX-6p-1双酶切
• 3.3 pGEX-6p1-MT亚克隆载体的构建
• 3.4 序列测定及分析
• 3.5 重组蛋白的表达形式
• 3.6 金属Zn离子诱导浓度
• 3.7 不同浓度IPTG诱导表达
• 4 讨论
• 4.1 金属诱导
• 4.2 表达载体的选择
• 5 结论
• Abstract
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式