六味地黄汤光合细菌代谢液的制备、药理及指纹图谱研究

论文摘要

六味地黄汤光合细菌代谢液（LW-PSB）是将优选的光合细菌作为菌种,引入到六味地黄汤中进行代谢,通过光合细菌的生物转化功能和自身营养价值的利用,制备出的六味地黄汤生物制剂,它是一种经过微生物发酵而形成的含有光合细菌菌体蛋白及其代谢分泌物、培养基和中草药发酵物的混合物。中药复方所含成分复杂,传统的质量标准采用化学对照品或者对照药材作为参比标准,试图用这些已知的化合物来控制中药的质量。但是,这些已知化学成分不能全面的代表该药物的疗效,一些未知的化学成分常常被认为对药效起重要作用,而这些未知的成分表现出复杂、数量巨大的特点。因此,传统中药质量控制方法是一种间接的、不完全的质量控制方法。LW-PSB是由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓等六味传统中药和光合细菌菌液以及培养基制备而成的,六味药材本身成分复杂,再加上各组分之间复杂的相互作用以及光合细菌的代谢过程,使其成分更加复杂。为了较好地控制LW-PSB的质量,本论文制备不同代谢条件的药液,在对其免疫调节作用考察的基础上,筛选出药效最好的样品,研究其对下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的作用,并建立各样品的HPLC药效指纹图谱,找出与免疫调节作用相关的化学成分,从而揭示化学信息与药效之间的相关性,文中还对药效相关成分的来源进行了研究。论文首先根据影响光合细菌生长的因素,就药液浓度、pH值、接种量、代谢时间4个因素设计了光合细菌在不同条件下代谢六味地黄汤的正交试验,由此制备得到了使用化学和豆浆两种培养基代谢的18份LW-PSB样品。之后课题组其他人员用甲状腺素联合利血平建立小鼠肾阴虚模型,分别给予小鼠这18份样品,研究结果表明,LW-PSB能改善肾阴虚小鼠症状,增加肾阴虚小鼠的体重,并对肾阴虚小鼠脾脏的萎缩有拮抗作用,这说明LW-PSB具有治疗肾阴虚和提高机体非特异性免疫作用。其中以样品H2、H5、H8、D1、D2、D5的药效最好,且与传统的六味地黄汤相比更具有优势。化学培养基组以H2的药效最好,即在pH2、接种量X2、六味地黄汤浓度C1的条件下以化学培养基代谢t2时间的药液;豆浆培养基组以D1的药效最好,即在pH1、接种量X1、六味地黄汤浓度C1的条件下以豆浆发酵液作为培养基代谢t1时间的药液。在此基础上,以治疗肾阴虚证效果最好的样品D1作为代表,论文深入研究了LW-PSB对肾阴虚小鼠HPA轴的影响,结果表明,肾阴虚小鼠服用LW-PSB后,能显著降低血浆促肾上腺激素释放激素（CRH）、促肾上腺激素（ACTH）、皮质酮（CorT）含量,即能对抗HPA轴功能亢进,使其恢复正常,说明LW-PSB调节HPA轴的平衡是其主要的药理作用之一。然后采用高效液相色谱技术,对LW-PSB使用乙腈-0.15%磷酸进行梯度洗脱,使其复杂的成分得以较好的分离,建立了LW-PSB的HPLC指纹图谱。接着将18份样品的HPLC指纹图谱与小鼠肾阴虚实验所测得的药理活性结果联系起来,以此建立LW-PSB的HPLC药效指纹图谱,并采用多元线性回归的方法,得到与药效相关的14个峰,其中11个峰成正相关（包括已知峰没食子酸和丹皮酚）,以X10对药效的影响最大。由回归的调整保留系数还可以看出,除已知成分外,LW-PSB中还有其他成分亦有显著的增强免疫力的活性,这有待于进一步研究。论文最后对于药效相关成分的来源进行了研究,结果表明X1、X6来源于茯苓,X2、X3、X11来源于山茱萸和牡丹皮,X4来源于山药和泽泻,X7来源于山茱萸,X9来源于山茱萸和山药,X10、X13、X15来源于牡丹皮,而X8、X12、X14则来源于多味药材。以上的研究为六味地黄现代生物制剂的研制提供了依据,同时也为六味地黄汤光合细菌代谢液的药效物质基础研究及质量控制与评价提供了参考数据,具有应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序言
• 第一章 综述
• 1.1 光合细菌的研究进展
• 1.1.1 PSB 的研究背景
• 1.1.2 PSB 的分类
• 1.1.3 PSB 的形态结构与生理功能
• 1.1.4 PSB 的营养成分
• 1.1.5 PSB 的应用
• 1.1.6 小结
• 1.2 光合细菌在医药保健品方面的研究应用
• 1.2.1 PSB 在保健品方面的研究应用
• 1.2.2 PSB 在医药方面的研究应用
• 1.2.3 小结
• 1.3 六味地黄汤的研究概况
• 1.4 微生物发酵中药的研究概况
• 第二章 六味地黄汤光合细菌代谢液的制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试药与仪器
• 2.1.2 光合细菌
• 2.1.3 培养基
• 2.2 六味地黄汤的制备
• 2.3 六味地黄汤光合细菌代谢液的制备
• 2.4 代谢过程中光合细菌的生长情况
• 2.5 LW-PSB 对肾阴虚小鼠的药效研究结果
• 2.6 小结
• 2.7 讨论
• 2.7.1 光合细菌的计数方法
• 2.7.2 六味地黄方的免疫调节功效
• 第三章 六味地黄汤光合细菌代谢液对肾阴虚小鼠HPA 轴调节作用研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 药物与试剂
• 3.1.2 动物
• 3.1.3 样品
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 LW-PSB 对肾阴虚模型小鼠的治疗作用
• 3.2.2 小鼠血浆激素水平测定
• 3.3 实验结果
• 3.4 小结
• 3.5 讨论
• 第四章 六味地黄汤光合细菌代谢液的HPLC 指纹图谱研究
• 4.1 试药与仪器
• 4.1.1 试药
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验方法与结果
• 4.2.1 样品处理
• 4.2.2 色谱条件
• 4.2.3 供试品溶液制备方法的优化
• 4.2.4 相对保留值的计算
• 4.2.5 方法学考察
• 4.2.6 样品的HPLC 指纹图谱测定
• 4.3 小结
• 4.4 讨论
• 4.4.1 样品处理方法
• 4.4.2 参比峰的选择
• 第五章 六味地黄汤光合细菌代谢液的HPLC 药效指纹图谱研究
• 5.1 相对保留值指纹图谱的建立
• 5.1.1 相对保留值α的计算
• 5.1.2 相对峰面积的计算
• 5.1.3 相对保留值指纹图谱的建立
• 5.2 方法与结果
• 5.3 小结
• 5.4 讨论
• 5.4.1 相对保留值
• 5.4.2 基准峰面积的选择
• 10'>5.4.3 芍药苷与X₁₀
• 5.4.4 质量控制方面
• 5.4.5 多元线性回归结果分析
• 5.4.6 丹皮酚的免疫调节作用
• 第六章 六味地黄汤光合细菌代谢液中药效相关成分来源的研究
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 试药与仪器
• 6.1.2 光合细菌
• 6.1.3 豆浆发酵液
• 6.2 样品的制备
• 6.2.1 六味地黄汤的制备
• 6.2.2 六味地黄汤发酵液的制备
• 6.2.3 单味药发酵液的制备
• 6.2.4 单味药光合细菌代谢液的制备
• 6.3 实验方法与结果
• 6.3.1 供试品溶液的制备方法
• 6.3.2 色谱条件
• 6.3.3 药效相关峰来源的研究
• 6.4 小结
• 6.5 讨论
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 缩写词注释
• 致谢