脊椎术中出血来源间充质干细胞不同分离方法的效果比较

论文摘要

目的通过三种分离方法分离脊椎术中出血标本中的间充质干细胞并进行培养,比较得到的单核细胞（Mononuclearcell,MNC）数、细胞贴壁情况、原代培养时间、传代至第三代后得到的细胞总数,探索针对脊椎术中出血来源间充质干细胞理想的分离培养方法。为进一步实验及应用提供实验基础。方法以12例胸腰椎骨折病人为实验对象。分别取术中脊椎松质骨出血标本30ml随机分为3等份,标记为A、B、C三组。A组采用密度梯度法,B组采用甲基纤维素（Methylcellulose,MC）沉降法,C组采用密度梯度结合甲基纤维素的两步法分离MNC,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养。72小时全量换液,以后3-5天按时换液,细胞达到汇合状态后进行胰蛋白酶消化传代。比较三种分离方法分离的MNC数、第三天贴壁细胞数、原代培养时间、第三代细胞数。倒置显微镜观察细胞形态及生长状态。流式细胞仪检测细胞表面标志鉴定细胞。结果用3种分离方法提取MNC数分别为：A组（6.99±0.77）×106,B组（11.5±1.70）×106,C组（8.20±0.96）×106,三组之间差异有统计学意义（P<0.05）。培养第三天观察细胞贴壁数分别为：A组11.40±2.37,B组为10.10±1.91,A组与B组两者之间的差异没有统计学意义（P>0.05）；C组24±3.27,与其它两组比较有统计学差异（P<0.05）比较三组原代培养时间,A组为28.20±1.69天,B组为28.40±2.12天, A组与B组之间的差异没有统计学意义（P>0.05）；C组为20.40±1.17天,与其它两组比较,差别有统计学意义（P<0.05）。传代培养3代后获得的细胞数,A组为（6.39±0.30）×106,B组为（5.54±0.42）×106, A组与B组比较没有统计学差异（P>0.05）；C组为（8.43±0.30）×106,与其它两组比较,差别有统计学意义（P<0.05）,三组培养细胞在倒置显微镜下观察,细胞形态一致,均为贴壁生长的长梭形或成纤维细胞样。流式细胞仪检测细胞表面标志,初次分离的细胞均有CD44表达阳性,CD34、CD45阳性率低,经过培养传代后均高表达CD29、CD44、CD90,而低表达CD14、CD34、CD45。结论脊椎术中松质骨出血标本中存在间充质干细胞,但数量较少,培养所得细胞经鉴定为间充质干细胞；甲基纤维素沉降结合密度梯度两步分离方法比其他两种方法有更好的培养效率,是分离单核细胞的较好方法；脊椎术中出血分离的间充质干细胞可以在体外进行有效的培养扩增,具有广泛的应用前景。

论文目录

• 1 脊椎术中出血来源间充质干细胞不同分离方法的效果比较
• 1.1 英汉缩略词对照表
• 1.2 中文摘要
• 1.3 英文摘要
• 1.4 前言
• 1.5 材料与方法
• 1.6 结果
• 1.7 讨论
• 1.8 结论
• 1.9 参考文献
• 2 综述
• 3 致谢