论文摘要
猪流感（SI）是一种非常普遍的猪的急性、热性和高度接触性呼吸道系统疾病,其病原主要是H1N1或H3N2亚型猪流感病毒（SIV）。由于猪可感染禽流感病毒和人流感病毒,被认为是流感病毒的混合器和新亚型流感病毒的加工场,因此,研制安全、有效的SIV疫苗来预防猪流感不但可以减少养猪业的经济损失,而且对食品安全和公共卫生具有重要意义。1.依靠内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）元件的双荧光表达载体的构建分别构建了EGFP和DsRed两个基因以两个表达盒串联的方式表达的质粒pIE-EGFP/DsRed和以IRES元件连接两个基因来表达EGFP和DsRed的质粒pIE-EGFP/IRES/DsRed。分别将两个质粒与伪狂犬病毒TK-/gE-/LacZ+的基因组共转染IBRS-2细胞（猪肾传代细胞）,可见转染的细胞均有绿色荧光和红色荧光表达。但是,在同一组质粒的转染中,上游基因EGFP的表达量明显高于下游基因DsRed。而且,质粒pIE-EGFP/IRES/DsRed中EGFP基因和DsRed的表达量都高于质粒pIE-EGFP/DsRed中EGFP基因和DsRed的表达量。因此我们选择用IRES元件连接的方式表达HA和NA基因。2.表达猪流感H1N1 HA基因和NA基因的重组伪狂犬毒株的构建以伪狂犬病毒通用转移载体pIECMV和质粒pIRES为基础,构建了猪流感病毒H1N1亚型HA和NA基因共表达的重组质粒pIE-HA/IRES/NA,将其与伪狂犬病毒TK-/gE-/LacZ+的基因组共转染IBRS-2细胞（猪肾传代细胞）。转染后的病变细胞悬液通过空斑纯化和PCR筛选获得了预期的重组病毒TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+。Western blot和间接免疫荧光分析表明所得病毒发生了预期的重组。3.重组伪狂犬毒株TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+生物学特性研究将TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+在PK-15细胞（猪肾传代细胞）上连续传10代后,每次取样制备模板均能用PCR检测到流感病毒H1N1亚型的HA和NA基因。PRV亲本株TK-/gE-/LacZ+和重组毒株TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+在PK-15细胞上连续传代3代并测定TCID50。结果表明缺失毒株TK-/gE-/LacZ+的TCID50为10-7.5/0.1ml,而TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+的TCID50为10-5.5/0.1 ml。生物学特性研究表明:该病毒遗传稳定性良好,但外源基因的插入对其在PK-15细胞上的增殖产生了一定的影响。4.重组伪狂犬毒株TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+安全性研究将重组病毒TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+以106.0TCID50的剂量接种6-8周龄的BALB/c小鼠6只,结果发现,小白鼠无任何异常情况,说明该重组病毒对小鼠是安全的。5.重组伪狂犬毒株TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+体液免疫研究将重组病毒TK-/gE-/HA+/IRES+/NA+免疫6-8周龄BALB/c鼠6只。免疫后2周和4周尾静脉采血用猪流感H1N1全病毒包被的ELISA板对其抗体进行检测。对BALB/c小鼠的免疫性试验表明:并且能够诱导小鼠产生抗H1N1全病毒的抗体。
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相关论文文献
- [1].信号肽序列对A型流感病毒H1N1 HA蛋白表达的影响[J]. 畜牧与兽医 2020(08)