论文摘要
作为模式动物,线虫以其个体微小、结构简单、易于培养、繁殖迅速、便于进行分子生物学实验分析及已知的基因图谱等优势在发育生物学、神经生物学等研究领域发挥重要作用。因其个体微小,常规实验方式难以对其进行准确操控,微流控芯片的应用弥补了这一缺陷。微流控芯片的微通道结构尺寸与线虫大小较匹配,便于对线虫实施各种操作,该技术已经在线虫固定成像、药物刺激、高通量筛选等诸多研究领域中发挥重要作用。例如,在线虫固定成像操作中可以利用锥形通道、气阀、侧吸通道、二氧化碳麻醉、冷却麻醉及热敏凝胶固定等方式实现对线虫的固定。固定好的线虫可以进行高精度实验操作,例如神经元激光烧蚀操作,这些优势较大的方便了线虫研究。由此可见,微流控芯片技术为线虫研究提供了有力的研究工具,并且在深度和广度上拓展了线虫研究的内容。在线虫的研究中,显微注射已经成为一种不可或缺的研究手段,实现显微注射首先需要固定线虫,微流控芯片侧吸固定法是众多线虫固定方法之一,但是无法应用于线虫的显微注射。本文在侧吸固定线虫成像的基础上发展出一种新型用于线虫微注射的开放式微流控芯片,将侧吸通道垂直切开,从而制作出一个侧壁含有侧吸通道的开放式腔室。通过侧吸,线虫被固定在此腔室的侧壁,暴露在芯片之外,方便显微操作。应用该技术,可以实现线虫显微注射、解剖和刺激等操作,例如,对假体腔、生殖腺及单个肠细胞进行显微注射。运用该微流控装置固定线虫,可以长时间保持线虫活性良好,这有利于进行精细实验操作与成像分析。另外,本文建立的开放式芯片单元可以与其他微流控单元集成,形成多功能的线虫分析装置。基于该新装置,本文进一步进行了线虫肠细胞钙信号机制的研究。线虫肠细胞内存在周期性、节律性钙信号,一种从尾端肠细胞自发产生的钙震荡。周期性钙信号是众多周期性行为分子机理,例如心脏的自发性周期性收缩。细胞质周期性钙震荡与线粒体及线粒体内呼吸链有密切关系,研究这些相互关系有利于揭示钙信号作用机理。线虫肠细胞为此类研究提供了较好的模型。研究线虫肠细胞钙信号的机制对于揭示钙震荡、钙信号传递等钙信号现象的机理具有重要意义。本文以开放式微流控芯片为平台对线虫肠细胞进行化学药物(毒胡萝卜素,TG)注射刺激和实时肠细胞钙成像分析。研究表明：TG显微注射线虫肠细胞可以显著性引起肠钙信号产生。在后端肠细胞注射TG之后,尾端肠细胞钙震荡被激发,钙震荡频率呈现逐渐加快的趋势,引起向前传递的钙波；我们对钙信号传递进一步分析发现钙信号被“过滤”的现象,即只有较强的钙震荡才能引起钙信号传递,较弱的钙震荡无法跨膜传递；此外,在肠细胞TG注射时,还会引起相应的尾部肌肉收缩,这是由于钙波从尾端肠细胞向前传递引起的。本文进一步对侧吸固定在芯片通道里的线虫肠细胞进行钙离子、氢离子浓度梯度刺激、光强刺激与玻璃微电极介导电刺激研究。线虫肠细胞可以作为研究自发钙信号、钙震荡和钙信号传递的良好模型,本文研究的开放式微流控芯片通过侧吸外置固定线虫的方式为此模型提供了良好的研究工具。线虫肠钙信号的相关机理还有待于深入研究,开放式微流控芯片的应用也可以进一步拓展。
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