田旋花和打碗花对草甘膦的耐药性研究

论文摘要

草甘膦(glyphosate)是一种传导型广谱灭生性除草剂,主要用于非耕地、果园、林地和农田作物种植之前防治一年生和多年生杂草,目前,越来越多地用于棉花和玉米田保护性喷雾防治田间杂草。田旋花(Convolvulus arvensis L.)、打碗花(Calystegia hederacea Wall.)均属旋花科多年生杂草,以地下根茎和种子进行繁殖,耕地除草时地下根茎易断裂,切断后的每段都能发出新芽,生命力极强,其地上茎缠绕周围的作物,对作物生长和产量造成严重危害,且不易防除。自然界中存在着对草甘膦耐药的田旋花种群(DeGenaro,1984)。本研究以田旋花和打碗花为对象,运用生物测定、生化检查和分子生物学等技术,研究田旋花和打碗花对草甘膦的耐药性。主要结论如下:(1)不同种群田旋花、打碗花对草甘膦的敏感性差异不显著。地上鲜重抑制率曲线是检测田旋花、打碗花对草甘膦耐性的适宜指标,田旋花对草甘膦具有很强的耐药性,打碗花只有一定程度的耐药能力。(2)草甘膦施用后1天,田旋花和打碗花体内莽草酸含量略大于对照,施用后6天,莽草酸积累,证明田旋花和打碗花对草甘膦的敏感性低,耐药能力强;相同草甘膦处理剂量下,单位质量的田旋花体内莽草酸的积累量明显少于打碗花的积累量,田旋花对草甘膦的耐药能力大于打碗花;随着田旋花生长时间的延长,对草甘膦耐性逐渐增强。(3)田旋花和打碗花的EPSP合成酶基因cDNA全长为1751bp,开放阅读框长1560bp,编码520个氨基酸,起始密码子位于51～53bp,终止密码子位于1611～1613bp,5’非翻译区98bp,一致性达97.94%,并推导出相应的氨基酸序列,一致性达到98.1%。(4)田旋花和打碗花的EPSP合成酶叶绿体转运肽长度均为72个氨基酸残基,一致性为94.4%,在转运肽段有8个位点氨基酸有差异占整个氨基酸序列中差异位点数的57%(8/14)。田旋花EPSP合成酶的101位丝氨酸为极性氨基酸,具有极性羟基基团,具有亲水性,而打碗花中为苯丙氨酸,是非极性疏水性氨基酸。(5)田旋花EPSP合成酶基因全长2953bp,含有6个内含子,7个外显子。7个外显子长度分别为390、310、219、60、217、63、315bp,最大的外显子为外显子1,长度390bp,最小外显子为外显子4,长度为60bp。6个内含子大小依次为393、220、365、172、124、105bp,最大的内含子为内含子1,长度为394bp,最小内含子为内含子6,长度为105bp。(6)田旋花101位氨基酸为丝氨酸,毗邻EPSP合成酶保守的活性位点,由于此极性氨基酸可以先与草甘膦结合,导致草甘膦无法竞争性地占据PEP结合位点,从而保护了活性区域,造成草甘膦不易与田旋花的EPSP合成酶结合,导致了田旋花对草甘膦的耐药性。综上所述,本研究首次对我国田旋花和打碗花对草甘膦的耐药性进行了研究,建立了耐药性检测指标,明确了草甘膦施用后田旋花、打碗花体内莽草酸含量的变化规律;首次克隆了田旋花、打碗花中EPSP合成酶cDNA全长基因,并将田旋花和打碗花EPSP合成酶基因cDNA序列在GenBank上登录(登录号分别为:EU698030、EU526078)。生物测定、酶水平和分子检测均证明:田旋花对草甘膦具有耐药性。本研究不仅完成了国家科技支撑计划规定的相关研究任务,而且为杂草科学家深入开展杂草对草甘膦的耐性机制研究,尤其是田旋花、打碗花的耐药性机制研究奠定了坚实基础,具有重要的理论和实践价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 导言
• 1.1 我国农田杂草危害与除草剂
• 1.1.1 农田杂草的危害
• 1.1.2 除草剂的发展与应用
• 1.2 抗药性杂草研究进展
• 1.2.1 抗药性杂草现状
• 1.2.2 抗药性杂草形成及影响其发展的因素
• 1.3 草甘膦与抗草甘膦作物的发展
• 1.3.1 草甘膦简介
• 1.3.2 草甘膦作用机理
• 1.3.3 草甘膦的生物降解
• 1.3.4 草甘膦发展现状
• 1.3.5 抗草甘膦作物的发展
• 1.4 抗草甘膦杂草的研究进展
• 1.4.1 抗草甘膦杂草的发展
• 1.4.2 杂草对草甘膦的抗性与草甘膦在植物体内的吸收、输导和分布
• 1.4.3 草甘膦对植物体内莽草酸积累水平的影响
• 1.4.4 杂草对草甘膦抗性的分子机制
• 1.5 田旋花和打碗花的研究现状
• 1.5.1 旋花科分属检索表
• 1.5.2 田旋花和打碗花分布特点及防治
• 1.6 本研究的意义与目的
• 第二章 田旋花和打碗花对草甘膦的耐药性生物测定
• 导言
• 2.1 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 研究方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 草甘膦对田旋花、打碗花和大豆的药效结果
• 2.2.2 草甘膦对田旋花、打碗花和大豆生长的抑制
• 2.2.3 草甘膦对不同种群田旋花和打碗花的草甘膦耐药性生物测定
• 2.2.4 草甘膦对田旋花、打碗花和大豆地上部分莽草酸含量的影响
• 2.2.5 草甘膦对田旋花、打碗花和大豆地下部分莽草酸含量的影响
• 2.2.6 草甘膦对不同生长时间田旋花体内莽草酸含量的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因CDNA片段的克隆
• 导言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 EPSPS基因片段的获得方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 植物总RNA的检测
• 3.2.2 田旋花和打碗花EPSPS基因片段的克隆
• 3.2.3 田旋花和打碗花EPSPS基因片段测序结果与分析
• 3.3 讨论
• 第四章 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因CDNA全长的克隆与分析
• 导言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 田旋花EPSP合成酶基因3’端的克隆
• 4.1.2 田旋花EPSP合成酶基因5’端的克隆
• 4.1.3 田旋花EPSP合成酶基因内含子情况
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因3’RACE结果
• 4.2.2 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因5’RACE结果
• 4.2.3 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因cDNA全序列拼接结果
• 4.2.4 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因cDNA全序列分析
• 4.2.5 田旋花和打碗花EPSP合成酶基因氨基酸及蛋白序列同源分析
• 4.2.6 田旋花EPSP合成酶基因内含子情况
• 4.3 讨论
• 4.3.1 RACE技术
• 4.3.2 EPSP合成酶的转运肽
• 4.3.3 高度保守的活性位点
• 4.3.4 田旋花EPSP合成酶全基因
• 第五章 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历