副溶血弧菌基因芯片及基因工程单链抗体检测研究

论文摘要

副溶血弧菌是一种广泛存在于水环境中的一种导致人类和水生动物发生疾病的一种致病菌。在本研究中,我们建立了一种基于基因芯片和基于基因工程单链抗体的融合蛋白的检测方法,对副溶血弧菌进行检测。以副溶血弧菌的基因组的特征性基因为出发点,利用副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）上的367 bp的片段检测TLH,耐热溶血毒素基因（tdh）上269 bp的片段检测TDH,鞭毛蛋白编码基因（FlaB）上的176 bp的片段检测FLAB,利用Bio-dUTP标记的液相三重PCR产物与特异探针（引物）的杂交,结合碱性磷酸酶检测系统,应用基因芯片技术同步检测副溶血弧菌的三个特有基因。实验中,使用了36份的实际样品对该检测体系作了进一步的验证分析,在检测的18株副溶血弧菌中,检测到有8株是强毒株,10株是弱毒株,这与实际的结果相符合。在检测的18株其他细菌中,均未发现任何的非特异性条带,这与实际的结果也是一致的。通过PCR扩增副溶血弧菌基因组中的约1.3 kb的tlh抗原基因,利用基因工程技术,构建了pET32a-tlh载体,将抗原基因与硫氧还原蛋白基因进行融合,转化大肠杆菌并进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明有一条与预测分子量大小相一致的目的条带,表达量约占菌体蛋白的45%左右,蛋白的可溶性高。融合蛋白末端的Trx标签增加蛋白的可溶性,His6标签有利于蛋白质的纯化。用纯化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,经过加强免疫后测定小鼠的抗血清效价,达到一定的效价后,从小鼠的脾脏中提取总RNA,反转录得到cDNA第一链,通过PCR扩增得到重链可变区VH和轻链可变区VL基因,组装成scFv并克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,构建噬菌体抗体库。通过噬菌体展示技术淘选得到一株高亲和力的单链抗体WW6。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 英文缩写表
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1. 副溶血弧菌的分子生物学
• 1.1 基因组DNA
• 1.2 质粒DNA
• 1.3 鞭毛基因系统
• 1.4 毒力因子
• 1.4.1 耐热溶血毒素
• 1.4.2 不耐热溶血毒素
• 1.4.3 耐热溶血毒素相关溶血毒素因子
• 1.4.4 尿素酶
• 2. 副溶血弧菌的检测
• 2.1 常规的细菌学检测
• 2.2 血清学-免疫学检测
• 2.3 基因检测
• 2.3.1 基因探针检测
• 2.3.2 PCR检测
• 2.3.3 其他方法
• 2.4 生物芯片检测
• 3. 生物芯片研究进展
• 3.1 生物芯片的分类
• 3.1.1 基因芯片
• 3.1.2 蛋白质芯片
• 3.1.3 芯片反应室
• 3.2 生物芯片的制备
• 3.2.1 芯片基质的选择
• 3.2.2 微列阵的制作
• 3.2.3 芯片生化反应
• 3.2.4 生物芯片的检测与结果分析
• 3.3 生物芯片的应用
• 3.3.1 生物芯片与疾病诊断
• 3.3.2 生物芯片与基因突变检测
• 3.3.3 生物芯片与基因表达分析
• 3.3.4 生物芯片与药物开发
• 3.3.5 生物芯片与环境科学
• 4. 基因工程单链抗体技术
• 4.1 单链抗体基因的获取与构建
• 4.2 单链抗体的表达
• 4.3 噬菌体抗体库的构建
• 4.3.1 噬菌体基本特征
• 4.3.2 噬菌体展示技术的基本原理
• 4.4 单链抗体融合蛋白研究
• 4.4.1 scFv融合蛋白与scFv稳定性
• 4.4.2 双功能融合蛋白
• 4.5 单链抗体的应用
• 4.5.1 靶向载体
• 4.5.2 诊断
• 4.5.3 治疗
• 第二章 副溶血弧菌的基因芯片检测
• 引言
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 PCR引物
• 2 实验方法
• 2.1 细菌基因组的提取
• 2.2 液相PCR
• 2.3 芯片反应室的制备
• 2.4 Bio-dUTP三重PCR
• 2.5 基因芯片杂交
• 2.6 芯片酶学检测
• 2.7 实际样品的检测
• 结果与分析
• 1 基因芯片杂交的原理
• 2 液相PCR
• 3 实际样品的检测
• 讨论
• 1 多重PCR
• 2 DNA-DNA杂交
• 3 灵敏度
• 4 实际样品的检测
• 结论
• 第三章 副溶血弧菌不耐热溶血素（TLH）的高效表达与鉴定
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂与材料
• 2 实验方法
• 2.1 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2 PCR扩增tlh基因
• 2.3 表达载体pET32a-tlh
• 2.4 大肠杆菌的转化
• 2.4.1 感受态细胞的制备
• 2.4.2 大肠杆菌的转化
• 2.5 重组质粒的筛选、检测
• 2.6 蛋白质的诱导生成
• 2.7 蛋白质的纯化
• 2.8 SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量
• 2.9 蛋白质的浓度测定
• 结果与分析
• 1 表达载体pET32a-tlh的构建
• 2 融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化
• 讨论
• 1 副溶血弧菌TLH的原核表达载体pET32a（+）-tlh的构建
• 2 融合蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化
• 结论
• 第四章 单链抗体的淘选
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞及细胞株
• 1.2 质粒载体
• 1.3 PCR产物
• 1.4 试剂与材料
• 1.5 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 动物免疫
• 2.2 测血清效价
• 2.3 总RNA的提取
• 2.4 第一链cDNA反转录合成
• 2.5 轻、重链基因的扩增
• 2.6 scFv DNA的组装与扩增
• 2.7 scFv DNA片段的sfi Ⅰ/Not Ⅰ酶切
• 2.8 pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建
• 2.9 重组噬菌体的制备
• 2.10 库容量的滴定
• 2.11 单链抗体噬菌体抗体库的富集淘选
• 2.12 用ELISA方法检测TLH蛋白质特异性的单链抗体
• 2.13 scFv序列分析
• 2.14 scFv可溶性表达与ELISA检测
• 2.15 scFv亲和力的测定
• 结果与分析
• 1. 效价的测定
• H和V_L的扩增'>2. V_H和V_L的扩增
• 3. scFv DNA的组装与扩增
• 4. 噬菌体抗体库载体的构建
• 5. 噬菌体抗体库的构建
• 6. scFv的噬菌体表面展示与淘选
• 7. scFv的特异性鉴定
• 8. scFv的酶切和PCR验证
• 9. scFv测序
• 10. scFv的可溶性表达与ELISA检测
• 讨论
• 1. 小鼠免疫与效价测定
• 2. RNA提取
• 3. scFv的组装与扩增
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录