论文摘要
油茶泛指山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）中具有生产价值的油用物种，是中国重要木本油料树种，其中普通油茶（Camellia oleifera Abel）栽培面积最广、产量最高，在生产中应用最广泛。自“六五”以来，研究者们在普通油茶果实产量、果实性状及采后加工、茶油营养成分、茶油储藏等方面开展了大量研究，并已获得了巨大进展。但对油茶种子发育过程中果实形状、种子的物质组成及重要性状控制基因的表达变化规律等研究较少。研究油茶果实和种子的生长发育规律，探索种子发育过程中重要营养成分的合成贮存规律，将为采用分子手段调控油茶种子重要营养成分合成，进一步提高茶油的营养保健价值奠定理论基础。本文分析了油茶果实和种子发育过程中表型性状、物质组成、重要性状基因表达量等指标的变化规律，具体研究内容如下：（1）分析了普通油茶长林系列4号、40号和166号3个无性系5-10月份果实果形、果重和种子的重量、鲜果出籽率等指标在果实生长过程中的变化规律。分析表明，3个无性系5月份果实大部分为圆橄榄形，8月份果形变化较大，到9月份基本分化成各无性系的特征果形；果实6-8月份间果实为迅速膨大期，果实重量和纵、横径大小在此时增长量最大，9月份之后果实重量和大小基本保持恒定；种皮厚度各月变化不大。种子重量和大小6-10月持续增长，其中6-8月份生长速度较快。鲜果出籽率6-8月迅速提高，9月份后基本稳定。因此6-8月是油茶果实及种子迅速生长期。（2）检测了长林系列4号、40号和166号3个无性系7-10月种子的主要物质组成，结论如下：3个无性系的种子含水率5-10月均处于逐渐下降的趋势，其中8-10月水分含量迅速下降。鲜籽含油率7-10月持续增加，而8-10月份增长幅度最大。蛋白质、淀粉含量与油脂含量的变化规律基本一致，可溶性糖含量各月份变化不大。茶皂素含量随种子成熟不断提高。可见8-10月份是普通油茶种子主要物质积累期。（3）采用solexa技术对长林4号无性系7-10月份种子进行转录组测序，获得大于200bp的unigene77050条。其中包括脂肪酸合成相关13个酶的99条unigene、脂肪酸链延长相关5个酶的8条unigene、7个脂肪酸去饱和酶的77条unigene，及与角鲨烯和茶皂素合成相关的4个重要酶的34条unigene等。并比较了7-10月份unigenes的RPKM值大小。（4）筛选了6个主要油茶物种的相对稳定的内参基因。参考其他物种的内参基因，并以RNA-Seq数据为基础，选择种子发育过程中表达量相对稳定的15个基因，用qRT-PCR方法分析15个基因在浙江红花油茶、宛田红花油茶、广宁红花油茶、攸县油茶、小果油茶和普通油茶等6个油茶物种的根、茎、叶、花、种子中表达量的稳定性，结果表明不同物种和不同组织最稳定的内参基因不完全一致，其中TUBα-3、CESA及ACT7α为各物种和组织的表达量相对稳定的内参基因。（5）以筛选出的CESA为内参，用qRT-PCR方法分析了4个脂类代谢途径29个相关酶基因不同时期的表达量，并进一步研究了在不同时期这些酶基因表达量与其相关代谢产物含量的相关性。比较采用qRT-PCR和RNA-Seq方法分析基因的表达量，结果表明两种方法检测的结果基本一致，但存在细微的差异。例如脂肪酸合成过程中BCCP基因、脂肪酸链延长的ECH基因和脂肪酸去饱和酶FAD8基因。基因表达与代谢相关产物含量变化相关性分析表明脂肪酸合成相关基因表达量变化提前于产物含量变化，而类固醇生物合成代谢中如角鲨烯合酶（SQS）和鲨烯环氧酶（SQE）基因表达量与角鲨烯和甾醇含量变化趋势一致。（6）克隆了油茶籽油中重要营养成分角鲨烯合成的两个关键酶SQS和SQE基因。采用RACE方法，分离的普通油茶SQS基因cDNA全长1490bp，开放阅读框1245bp，编码414个氨基酸，SQE基因cDNA全长2058bp，开放阅读框1605bp，编码534个氨基酸。采样同源克隆方法，也分离出浙江红花油茶、宛田红花油茶、广宁红花油茶、攸县油茶、小果油茶的SQS和SQE基因，6个油茶物种中SQS和SQE基因cDNA同源性分别达到99.44%和99.47%（7）利用pMDC32真核表达载体验证了油茶SQS和SQE的功能。采用Gateway技术分别构建了油茶SQS和SQE基因超表达载体pMDC32-SQS和pMDC32-SQE，表达载体通过农杆菌EHA105介导转化到粘红酵母中，利用PCR检测筛选阳性转化子，培养阳性转基因酵母菌株，提取酵母油脂，分析油脂中角鲨烯和甾醇含量。结果表明，转pMDC32-SQS的粘红酵母油脂中角鲨烯和甾醇含量分别低于对照26.26%和38.8%，而转pMDC32-SQE的粘红酵母油脂中甾醇含量比野生型提高202.62%，角鲨烯含量降低了41.09%。但相同的培养时间内，单位体积的培养基中两组转基因粘红酵母培养相同时间后，pMDC32-SQS和pMDC32-SQE的粘红酵母油脂酵母的产量比对照分别提高了81.96%和183.52%，总油脂产量也相应分别提高了69%和175%。本研究基本明确了油茶果实和种子发育过程中形态、组分及脂类代谢相关基因表达量的变化规律，分析了脂类代谢部分基因的表达量与其相关产物含量变化的关系，为今后更加系统深入的研究油茶种子发育调控打下基础，也为改进育种和栽培措施，提高油茶效益提供理论参考。