论文摘要
[背景]血管生成对实体瘤的生长及转移非常重要。肿瘤中的新血管形成与患者的预后密切相关,阻断肿瘤的血管形成能抑制肿瘤的生长和转移。自Folkman提出肿瘤的“休眠疗法”（dormancy therapy）以来,已发现了大量的血管生成抑制剂。血管能抑素（canstatin）来自Ⅳ型胶原α2链的NC1区,编码227个氨基酸残基,分子量约为24kD。近期研究证实血管能抑素在体外有抑制内皮细胞迁移和增殖的作用,并可以诱导其凋亡,在体内可抑制肿瘤生长。[目的]本实验采用电穿孔法转染canstatin基因至人淋巴细胞和人肺腺癌A549细胞中,构建canstatin蛋白真核表达系统,观察canstatin基因在培养上清中的表达;建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,并将上清作用于移植瘤模型,观察对肿瘤生长和转移的影响。[方法]将canstatin基因分泌型重组载体（pCMV-Script-CEAS-Cans）通过电穿孔法转染A549细胞和人淋巴细胞,并用空载体pCMV-Script转染细胞作为对照;G418筛选转染细胞获得阳性克隆,PCR法鉴定阳性克隆细胞canstatin在基因组中的整合;SDS-PAGE检测转染细胞培养上清中canstatin蛋白的表达,收集培养上清并超滤浓缩后备用。以Lewis肺癌细胞在C57BL小鼠右侧腹股沟皮下接种,从而建立C57BL小鼠Lewis肺癌模型;取25只成瘤小鼠（瘤体大小相近,约1cm3）,随机分成五组,分别在瘤内注射重组载体转染淋巴细胞培养上清、重组载体转染A549细胞培养上清、空载体转染淋巴细胞培养上清、空载体转染A549细胞培养上清和生理盐水各0.2ml,每日1次,连续14日;隔日观察小鼠体重和肿瘤体积。第15日颈椎脱臼法活杀小鼠,解剖检测瘤重大小及肺转移结节数量,HE染色观察各组原位肿瘤及肺部病理改变,免疫组化观察各组肿瘤的微血管密度。同法建立小鼠Lewis肺癌模型,分为三组分别注射重组载体细胞培养上清、空载体细胞培养上清和NS,观察荷瘤小鼠的生存时间;并观察小鼠一般情况、肿瘤局部浸润情况。[结果] PCR可检测到重组载体转染细胞的基因组中存在canstatin基因,蛋白电泳发现其培养上清中有canstatin蛋白的表达,而空载体转染细胞组中无表达。成功建立了小鼠Lewis肺癌移植瘤模型;治疗14天后,重组载体转染的A549细胞上清组和淋巴细胞上清组的肿瘤体积及瘤重分别为1.47±0.21cm3、1.17±0.12g和1.49±0.18 cm3、1.21±0.28g,明显小于
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