c-Abl非受体酪氨酸激酶调节C/EBPβ转录活性的研究

论文题目: c-Abl非受体酪氨酸激酶调节C/EBPβ转录活性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 李晓荣

导师: 马清钧,曹诚

关键词: 非受体型酪氨酸激酶,磷酸化,转录活性

文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 生命活动中的一系列重要过程如细胞增殖、分化,及特定细胞功能的执行与基因表达的迅速改变相关,这种基因表达控制主要通过特定转录因子与靶基因启动子和增强子调节序列的互作实现。C/EBPB（NF-IL6）是近二十年来对无数调节基因的研究中发现的一个功能极其广泛的转录因子,在众多细胞反应中发挥关键调节作用,如细胞分化、代谢、造血,脂肪形成、免疫系统和癌症发生等,其功能缺损和失调必然导致细胞病理生理状态。c-abl （cellular-Abelson gene）是Abelson鼠白血病病毒（murineleukemia virus）v-abl原癌基因在细胞内的同源基因,该基因编码分子量为140kDa的蛋白,属于Src非受体酪氨酸激酶家族的成员,广泛表达于哺乳动物各组织中。生理状态下的c-Abl定位在细胞质、细胞核、质膜、内质网、线粒体、细胞骨架等多种亚细胞结构中,依赖其独特的N端和C端结构域,通过与细胞内激酶、磷酸酶、细胞周期调节因子、转录因子、细胞骨架蛋白、核孔蛋白等多种分子间的蛋白-蛋白相互作用和其激酶活性参与细胞增殖和存活、细胞骨架的重组、细胞迁移、发育、炎症反应及恶性转化等过程的调控。 对c-Abl和C/EBPβ参与的细胞效应进行分析,我们发现c-Abl与转录因子C/EBPβ具有许多功能上的相似性和共同点,两者都在细胞增殖、存活、细胞凋亡和炎症反应中发挥作用。近年的研究表明Abl酪氨酸激酶组成型激活导致的慢性粒细胞白血病,与C/EBP的下调表达而使粒细胞分化失败有关,因而推测c-Abl酪氨酸激酶活性与转录因子的转录活性之间可能存在某种联系。以全长c-Abl为诱饵蛋白,采用酵母双杂交法筛选Hela细胞cDNA库,发现c-Abl可与转录因子C/EBPβ相互作用。 在本论文中,首先我们通过免疫沉淀和免疫印迹实验证实了c-Abl与C/EBPβ可以在细胞内和体外相互作用,用体外翻译[35S]Met标记的Flag-Abl与GST-C/EBPβ在体外的结合实验进一步证实c-Abl与C/EBPβ可以直接结合;进一步我们通过体外翻译

论文目录:

缩略词表

中文摘要

Abstract

前言

1.转录因子C／EBPβ的结构、功能与调控

2.c-Abl酪氨酸激酶的结构与功能

材料和方法

1.材料

1.1 引物合成及序列测定

1.2 细胞株、菌株、质粒

1.3 分子生物学工具酶

1.4 细胞培养用品

1.5 常用分子生物学试剂盒

1.6 Western-blot试剂

1.7 大型仪器

2.方法

2.1 常规PCR反应、重组质粒构建和阳性克隆的鉴定

2.2 Flag-C／EBPβ(Y79F)突变体的构建

2.3 GST-C／EBPβ截短突变体的构建

2.4 C／EBPβ siRNA表达载体的构建

2.5 转染质粒的制备

2.6 细胞培养、冻存与转染

2.7 谷胱甘肽S转移酶(Glutathion S-transferase，GST)融合蛋白的制备

2.8 免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)与免疫印迹(Immunoblot，IB)

2.9 体外结合实验(GST-pull down)

2.10 体外激酶分析

2.11 蛋白质浓度的测定

2.12 Pulse-Chase实验检测蛋白质的半衰期

2.13 荧光素酶活性检测

2.14 细胞同步化实验

2.15 流式细胞技术检测细胞周期

2.16 凝胶阻滞实验

结果与分析

1.c-Abl／ARG与转录因子C／EBPβ之间存在相互作用

1.1 c-Abl和Arg与C／EBPβ在细胞内形成复合物

1.2 c-Abl与C／EBPβ直接结合

1.3 c-Abl与C／EBPβ相互作用结构域

2.C／EBPβ可被c-Abl／Arg磷酸化

2.1 c-Abl和Arg磷酸化C／EBPβ

2.2 C／EBPβ的Y79位酪氨酸被c-Abl和ARG磷酸化

3、c-Abl／Arg抑制转录因子C／EBPβ的降解

3.1 c-Abl／Arg调节细胞内C／EBPβ的表达水平

3.2 c-Abl 抑制C／EBPβ降解

4、c-Abl酪氨酸激酶抑制细胞内C／EBPβ LIP异构体的形成

5、c-Abl酪氨酸激酶促进C／EBPβ与IL-6靶序列的结合

6、c-Abl调控C／EBPβ的转录激活活性

6.1 酪氨酸磷酸化提高C／EBPβ对IL-6基因的转录激活作用

6.2 酪氨酸磷酸化激活C／EBPβ对hTOP1基因的转录激活作用

7、C／EBPβ参与细胞周期素D1调节的生物学效应

7.1 Abl酪氨酸激酶调节C／EBPβ与Cyclin D的相互作用

7.2 C／EBPβ拮抗c-Abl对细胞周期素CyclinD1转录激活

7.3 C／EBPβ拮抗c-Abl对细胞周期素CyclinD1下游基因的转录激活

讨论

1.c-Abl酪氨酸激酶家族与转录因子C／EBPβ之间的相互作用

2.c-Abl酪氨酸激酶通过磷酸化影响C／EBPβ的转录活性

3.c-Abl调节C／EBPβ的DNA结合能力及LAP／LIP比例

4.c-Abl可通过对C／EBPβ酪氨酸磷酸化调控细胞周期

结语

参考文献

文献综述

附录

致谢

发布时间: 2005-09-05

参考文献

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