H2O2对玉米幼苗和表达CaM转基因烟草悬浮细胞脯氨酸代谢的影响

论文摘要

本文以玉米幼苗和本实验室建立的表达细胞质CaM的转基因烟草悬浮细胞为材料,研究了外源H2O2处理与脯氨酸代谢之间的关系及CaM在其中的调控作用。研究工作主要包括以下两个方面：1、H2O2处理对玉米幼苗脯氨酸代谢的影响我们用40 mmol/L H2O2处理培养了72个小时的玉米幼苗24小时,用以研究外源H2O2处理对玉米幼苗胚芽鞘和胚根中脯氨酸代谢的影响。结果表明：外源H2O2能引起玉米幼苗体内脯氨酸的累积,随着处理时间的延长,脯氨酸含量迅速上升,前期参与这个累积过程的主要是谷氨酸合成途径,到后期脯氨酸合成的鸟氨酸途径也被激活,处理后期脯氨酸的大量累积实质上是两条途径共同作用的结果,同时降解酶脯氨酸脱氢酶（ProDH）的活性也被抑制。此外,我们还利用RT-PCR技术扩增了玉米幼苗吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因的一个片断,分析了H2O2处理下P5CS基因表达的强弱。结果与酶活性变化的趋势-致,随着处理时间的延长,P5CS基因的表达量明显增加,表明外源H2O2从基因表达的层面上就调控着P5CS的活性。2、CaM在H2O2诱导的脯氨酸累积中的作用用1 mmol/L H2O2处理表达细胞质CaM转基因烟草H1-2C和对照H02020的悬浮培养细胞,得到的结果与第一部分相似,外源H2O2能引起烟草悬浮细胞中脯氨酸的累积,在这个过程中,降解酶ProDH的活性被抑制,前期参与合成的主要是谷氨酸途径,而后期起主要作用的是鸟氨酸合成途径。在H2O2处理下,CaM水平较高的H1-2C中累积的脯氨酸量高于对照HO2020,加入CaM拮抗剂CPZ可抑制这种效应,说明CaM对H2O2引起的烟草悬浮细胞中脯氨酸的累积具有调控作用。通过对脯氨酸代谢三种关键酶活性的测定,发现较高的CaM水平对P5CS和ProDH的活性影响不大,但能显著提高OAT的活性且这种效应能被CPZ抑制,说明CaM是通过调控鸟氨酸途径来影响H2O2引起的烟草悬浮细胞中脯氨酸的累积的。以上研究结果表明,外源H2O2能引起玉米幼苗和烟草悬浮细胞中脯氨酸的累积,前期参与脯氨酸合成的主要是谷氨酸途径,后期鸟氨酸途径被激活,同时降解酶活性被抑制。在烟草中CaM对H2O2引起的脯氨酸累积过程具有调控作用,且这种作用是通过对鸟氨酸途径的调控来实现的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 脯氨酸在植物逆境胁迫中的作用
• 1.2 脯氨酸的代谢途径
• 1.3 植物脯氨酸合成的关键酶-P5CS
• 1.4 活性氧与脯氨酸代谢的关系
• 2+/CaM信号系统与脯氨酸代谢关系的研究现状'>1.5 Ca²⁺/CaM信号系统与脯氨酸代谢关系的研究现状
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 玉米材料的培养
• 2.1.2 烟草愈伤组织的培养
• 2.1.3 烟草悬浮细胞的培养
• 2.2 处理方法
• 2O₂处理'>2.2.1 H₂O₂处理
• 2.2.2 CaM拮抗剂处理
• 2.3 测定方法
• 2.3.1 脯氨酸含量的测定
• 2.3.2 P5CS的提取与测定
• 2.3.3 GDH的提取与测定
• 2.3.4 OAT、Arginase的提取与测定
• 2.3.5 ProDH的提取与测定
• 2.3.6 CaM的提取
• 2.3.7 CaM的测定
• 2.3.8 无机磷的测定
• 2.3.9 蛋白质的测定
• 2.3.10 玉米RNA的提取（TRIzol法）
• 2.3.11 RT-PCR
• 2.3.12 PCR产物的纯化
• 2.3.13 P5CS基因片段扩增产物的测序及序列分析
• 2.4 数据处理
• 2.5 试剂与仪器
• 第3章 实验结果
• 2O₂处理对玉米幼苗脯氨酸代谢的影响'>3.1 外源H₂O₂处理对玉米幼苗脯氨酸代谢的影响
• 2O₂处理浓度的确定'>3.1.1 H₂O₂处理浓度的确定
• 2O₂处理对玉米幼苗脯氨酸含量的影响'>3.1.2 H₂O₂处理对玉米幼苗脯氨酸含量的影响
• 2O₂处理对玉米幼苗脯氨酸代谢关键酶活性的影响'>3.1.3 H₂O₂处理对玉米幼苗脯氨酸代谢关键酶活性的影响
• 2O₂处理对玉米幼苗P5CS基因表达的影响'>3.1.4 H₂O₂处理对玉米幼苗P5CS基因表达的影响
• 3.2 CaM在H2O2诱导的脯氨酸累积中的作用
• 3.2.1 转基因烟草H1-2C和对照H02020悬浮细胞中CaM的活性
• 2O₂处理浓度的确定'>3.2.2 H₂O₂处理浓度的确定
• 2O₂处理对转基因烟草悬浮细胞脯氨酸含量的影响'>3.2.3 H₂O₂处理对转基因烟草悬浮细胞脯氨酸含量的影响
• 2O₂处理对转基因烟草悬浮细胞CaM活性的影响'>3.2.4 H₂O₂处理对转基因烟草悬浮细胞CaM活性的影响
• 2O₂处理下CaM活性与脯氨酸含量变化的相关性分析'>3.2.5 H₂O₂处理下CaM活性与脯氨酸含量变化的相关性分析
• 3.2.6 CaM拮抗剂CPZ处理对转基因烟草悬浮细胞CaM活性和脯氨酸含量的影响
• 2O₂及CPZ处理对转基因烟草悬浮细胞脯氨酸代谢关键酶活性的影响'>3.2.7 H₂O₂及CPZ处理对转基因烟草悬浮细胞脯氨酸代谢关键酶活性的影响
• 第4章 讨论
• 2O₂对玉米幼苗和烟草悬浮细胞脯氨酸代谢的影响'>4.1 外源H₂O₂对玉米幼苗和烟草悬浮细胞脯氨酸代谢的影响
• 2O₂引起的烟草悬浮细胞中脯氨酸累积的调控'>4.2 CaM对H₂O₂引起的烟草悬浮细胞中脯氨酸累积的调控
• 结束语
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果