论文摘要
研究目的1.研究不同剂量血液滤过对内毒素休克猪生存率、血流动力学、氧合作用和炎症的影响,探讨相应的机制,包括对血浆细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10和IL-18）水平、单核细胞功能和中性粒细胞凋亡和NK-κB的作用;2.研究连续性血液滤过治疗sepsis的合适剂量。研究方法1.动物模型的建立采用静脉注射内毒素（E.coli O111:B4,15.7μg/kg）的方法诱导内毒素休克猪模型,当平均动脉压（MAP）下降30%时,标志内毒素休克猪模型建立。2.建立体外循环行左侧股静脉和左侧颈外静脉穿刺术,分别置入8F单腔导管,作为CVVH时的动脉端以及静脉回血端,连接百特BM 25床旁CRRT机,采用Gambro Filtral12聚丙烯腈膜滤器（AN69,1.2 m2）,血流量为150 ml/min。3.分组将18只内毒素休克猪（28.1±5.1kg）随机分成三组:对照组（n=6）、CVVH组（n=6,置换液速度为55 ml/kg·h,前稀释法,相当于后稀释法的45 ml/kg·h）和高容量血液滤过（HVHF）组（n=6,置换液速度为100 ml/kg·h,前稀释法,相当于后稀释法的70 ml/kg·h）,治疗24h后处死动物。4.观察指标1)血流动力学指标:每小时监测内毒素休克猪心率（HR）、平均动脉压（MAP）、体温（T）、呼吸（P）、脉搏氧饱和度（SpO2）、平均肺动脉压（Mean Pulmonary Arterial Pressure,mPAP）、肺动脉楔压（Pulmonary Artery Wedge Pressure,PAWP）、中心静脉压（Central Venous Pressure,CVP）、心排出量（Cardial Output,CO）、心脏指数（CardialIndex,CI）、每搏量（Stroke Volume,SV）、每搏指数（Stroke Index,SI）、体循环阻力指数（Systemic Vascular Resistance Index,SVRI）、肺循环阻力指数（PulmonaryVascular Resistance Index,PVRI）和左室每搏作功指数（Left Ventricular Stroke WorkIndex,LVSWI）。2)氧合作用相关指标:每2小时送检血气,测定动脉血pH值、动脉氧分压（PaO2）、动脉二氧化碳分压（PaCO2）、动脉血氧饱和度（SaO2）、碱剩余（BE）、HCO3-和氧合指数（oxygenation index,OI=PaO2/FIO2）。3)生存时间、血常规和肾功能:记录内毒素休克猪的生存时间和尿量,测定造模前（Baseline）、成模时（TO）、成模后6h（T6）、12h（T12）、24h（T24）血常规和肾功能。4)细胞因子:ELISA法测定Baseline、T1、T0、T6、T12、T24各时点血浆细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18）的水平。5)单核细胞功能和中性粒细胞凋亡:流式细胞术测定Baseline、T0、T6、T12、T24各时点单核细胞MHCⅡ的表达和中性粒细胞凋亡的水平,予LPS（10μg/ml）刺激各时点单核细胞24h,ELISA法测定上清中TNF-α的含量。6)肺和肾组织病理:肺和肾组织行HE染色,免疫组化法观察p65和细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）在肺和肾的表达,ELISA法测定肺和肾组织的NF-κB活性。结果1.第一部分内毒素休克猪成模时HR、mPAP、PAWP和PVRI升高,MAP、SVRI、SV、SI、LVSWI、OI和BE下降（P＜0.05）,其余指标无明显变化。治疗24h后,CVVH组和HVHF组的LVSWI和OI较对照组明显升高（P＜0.05）,但两组之间无显著性差异。2.第二部分对照组动物平均生存时间为（15.4±5.2）h,CVVH组为（21.4±4.1）h,HVHF组为（22±6.7）h,CVVH组和HVHF组的生存时间显著高于对照组（P＜0.05）。对照组Scr和BUN分别从成模后6h和12h开始升高,后进行性恶化。HVHF组和CVVH组的BUN分别于成模后12h和24h开始低于对照组（P＜0.05）,两组的Scr分别于成模后6h和12h开始低于对照组（P＜0.05）,三组动物成模后血小板进行性下降,各组之间的红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板数量均无显著性差异（P＞0.05）。成模后各组尿量均下降,治疗后12h HVHF组尿量高于另外两组（P＜0.05）,治疗后18h、24h,CVVH组和HVHF组尿量高于对照组,两组之间无显著差异。3.第三部分对照组TNF-α和IL-6水平在T1达最高峰,IL-10水平在T0达最高峰,随后不断下降,IL-18水平在成模后上升,后无明显变化。CVVH组血浆IL-10（T6、T12、T24）水平低于对照组（P＜0.05）,HVHF组TNF-α（T6）和IL-10（T6、T12、T24）水平低于对照组和CVVH组（P＜0.05）,三组的IL-6和IL-18水平无显著性差异（P＞0.05）,IL-6（T6、T12）水平与动物生存时间呈负相关（P＜0.05）。4.第四部分成模时三组单核细胞分泌的TNF-α水平较成模前无明显变化（P＞0.05）,成模后6h TNF-α水平最低,后逐步回升,三组之间无显著差异（P＞0.05）。成模时三组MHCⅡ表达较成模前无明显变化（P＞0.05）,成模后MHCⅡ表达呈进行性下降,三组之间无显著性差异（P＞0.05）。成模时各组中性粒细胞（PMN）凋亡较成模前减少（P＜0.05）,治疗后24h HVHF组PMN凋亡高于对照组和CVVH组,差异有统计学意义（P＜0.05）。成模时,各组PMN数量均下降,但百分比无明显变化,成模后各时点PMN数量和百分比均大于成模前（P＜0.05）,治疗12h、24h后HVHF组PMN数量和百分比较对照组和CVVH组显著下降（P＜0.05）。5.第五部分CVVH组和HVHF组肺组织的水肿、间质浸润、透明膜和肺不张病变较对照组减轻（P＜0.05）,CVVH组和HVHF组肾小球和肾小管病变较对照组显著减轻（P＜0.05）,两组之间肺和肾的改变均无显著性差异。p65和ICAM-1在内毒素休克猪肺、肾组织中的表达均增加,CVVH组与HVHF组肺、肾组织中NF-κB活性、p65表达和ICAM-1表达较对照组均显著下降（P＜0.05）,两组之间无显著性差异（P＞0.05）。结论1.CVVH和HVHF治疗均能一定程度地改善内毒素休克猪的心脏泵血功能和氧合作用,增加置换液剂量对血流动力学和氧合作用无额外的作用。2.CVVH和HVHF治疗能显著延长内毒素休克猪的生存时间。内毒素休克猪出现急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）,且肾功能进行性恶化,连续性血液滤过治疗能有效改善肾功能,增加实验动物的尿量。3.CVVH治疗能有效清除IL-10,HVHF治疗能清除TNF-α和IL-10,但CVVH和HVHF对IL-6和IL-18水平无明显影响。IL-6水平是预测内毒素休克预后的独立指标。4.内毒素休克猪成模后出现免疫抑制,表现为单核细胞MHCⅡ表达下降、分泌TNF-α水平的下降和中性粒细胞凋亡的减少。CVVH和HVHF治疗对单核细胞抗原递呈功能和分泌功能均无影响,但HVHF能抑制PMN凋亡的减少,减少外周PMN的数量和百分比。5.CVVH和HVHF通过抑制NF-κB的机制来减轻肾和肺组织损伤和减少ICAM-1的表达。
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