论文摘要
绿色木霉几丁质酶是一种内切几丁质酶,它能从几丁质链的内部切割β-1,4糖苷键,产生几丁寡糖。自然界每年生成的几丁质约有100亿吨,是地球上除了纤维素以外数量最多的有机化合物。目前,国内外对于几丁质酶的研究虽然取得了一定成果,但还没有产业化。分离新的几丁质酶基因并构建高效表达工程菌,对实现几丁质酶产业化具有十分重要的意义。本研究采用RT-PCR及PCR技术,从绿色木霉中分离内切几丁质酶基因ECH,并分析了该基因的cDNA序列,构建了原核表达载体,通过SDS-PAGE对该基因表达的蛋白产物进行了分析,用DNS法测定了重组菌产生的内切几丁质酶活力,在此基础上对该酶的生化性质进行了初步研究。另外,初步研究了重组菌产酶条件的优化。本研究主要取得了以下结果:1.根据已克隆的内切几丁质酶基因序列的同源性比较,设计引物,采用PCR技术从绿色木霉基因组中分离出一个大小1467bp的特异DNA片段,采用RT-PCR技术从绿色木霉总RNA中分离出大小约1276bp的cDNA片段。序列对比后发现绿色木霉内切几丁质酶基因含有三个内含子,大小分别为52bp、69bp、64bp。2.对绿色木霉内切几丁质酶全长cDNA序列和已经报道的内切几丁质酶序列进行同源性分析,结果显示,该克隆片段与Trichoderma harzianumX79381.1、Trichoderma viride AF188924基因的同源性高达100%,与Trichoderma sp.w512 DQ462415.1、Trichoderma virideEF635427.1、AF208842.1、Trichoderma aureoviride AY850032.1和Trichoderma hamatumU88560.1同源性高达95%以上。3.绿色木霉内切几丁质酶基因编码—酸性蛋白,等电点pI为4.95。预测编码蛋白的氨基酸序列含424个氨基酸残基,预测分子量为46kDa。绿色木霉内切几丁质酶蛋白164-172位氨基酸是几丁质酶18家族的活性位点,序列为FDGIDVDWE。用同源建模法模拟出绿色木霉内切几丁质酶的空间结构模型。4.根据测序结果,设计两对引物,扩增出带绿色木霉内切几丁质酶自身信号肽基因ECH和成熟的内切几丁质酶基因MECH。利用载体pET28a,构建原核表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH。经验证分析表明,所克隆的基因ECH和MECH已置于表达载体的正确阅读密码框下。5.包含pET28a-ECH和pET28a-MECH重组菌经诱导表达后经SDS-PAGE分析,蛋白的分子量均为42kDa。通过对表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH的SDS-PAGE几种参数包括时间、IPTG浓度诱导表达分析,结果显示pET28a-ECH最佳诱导时间为3h,pET28a-MECH诱导时间3-4h时表达量最高;pET28a-ECH最佳诱导IPTG浓度为1.0mmol/L。用DNS法对表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH产生的几丁质酶粗酶液的酶活进行初步测定发现,表达载体pET28a-MECH酶活高于pET28a-ECH。6.通过对重组几丁质酶的生化性质的研究发现,该酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH为7.0。酶的热稳定性不好,容易失活。添加低浓度（1.0mM）的金属离子Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Na+对酶活力有促进作用,Ca2+、Zn2+、Co2+对酶有抑制作用。另外,底物胶态几丁质的浓度对酶活测定也有很大的影响。7.通过对内切几丁质酶重组大肠杆菌的培养条件的研究发现,培养1h添加诱导剂1.0mmol/L IPTG,有利于酶活的提高。摇瓶培养中,5%的接种量最为合适,100mL装液量（500mL三角瓶）酶活最高。