濒危名贵药用霍山石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究

论文摘要

石斛作为传统名贵中草药，其资源再生，化学成分和药理活性逐渐引起人们的关注，多糖是石斛属植物中主要的药用活性成分之一。本文以传统的名贵珍稀药用植物——霍山石斛为主要研究对象，在建立霍山石斛类原球茎多糖高效表达悬浮培养体系的基础上，利用生物大分子研究的最新技术和现代分离分析手段与药理实验方法，对霍山石斛类原球茎水溶性多糖进行了提取分离纯化，并对其主要活性多糖组分HPS-1B23的组成和一级结构进行了研究。主要研究结果如下：（1）以霍山石斛试管苗茎段为外植体，首次诱导获得了类原球茎，并建立了类原球茎的培养体系。其中附加NAA(7.5μmol L-1)和KIN(0.5μmol L-1)组合的MS培养基最利于类原球茎的形成，诱导率达到79.9％。诱导的类原球茎经长期继代培养后，从生长、植株再生、活性多糖合成、药理作用、单糖组成及基因组DNA多态性等方面进行品质稳定性分析，表明诱导获得的类原球茎系在品质上是稳定的。（2）药理学研究证明了培养的类原球茎具有野生霍山石斛同样的合成活性多糖的能力。野生霍山石斛总多糖能显著促进小鼠脾细胞和巨噬细胞分别产生IFN-γ和TNF-α，多糖作用浓度分别在800μg mL-1和200μg mL-1。RT-PCR分析表明，总多糖是通过上调或下调IFN-γ和TNF-α的基因表达来控制各自的释放量的。经DEAE-Cellulose离子交换色谱层析，从类原球茎总多糖中分离出和野生霍山石斛相同的5个多糖组分，并表现出同样的促进小鼠脾细胞和巨噬细胞分别产生IFN-γ和TNF-α的能力，其中以水洗脱部分HPS-1含量最大。建立的多糖活性评价方法实现了对霍山石斛类原球茎培养体系的质量监控。（3）研究分析了霍山石斛类原球茎液体培养过程中碳、氮代谢特征，阐明霍山石斛类原球茎生长和多糖合成与细胞内源和外源碳、氮的关系。在整个培养过程中，没有观察到显著的细胞生长延滞期，培养30d后，生物量达到最大，多糖合成与类原球茎生长表现出了非同步的关系。细胞培养启动后，在前3d培养基中蔗糖浓度减少了一半，同时无葡萄糖和果糖的存在，之后随着蔗糖浓度的继续下降，培养基中逐渐检测到有葡萄糖和果糖的存在，到第9d含量达到最大值。相反，类原球茎内源蔗糖随培养的启动，在培养的前6d，快速积累，之后快速被消耗；内源葡萄糖和果糖含量也同时有一定程度的增加，培养9d后逐渐被消耗。可溶酸性蔗糖酶和碱性蔗糖酶随类原球茎培养的启动逐渐被激活，分别在培养的第6d和第18d活性达到最大值。细胞壁蔗糖酶在整个培养过程中活性很低，一直处于被抑制

论文目录

中文摘要

英文摘要

第一章药用石斛资源及其可持续利用现状

1.药用石斛应用及其资源现状

2.药用石斛资源再生现状

2.1 药用石斛的野生变家种

2.2 药用石斛的组织培养

3.药用石斛化学成分及药理作用

4.课题构想

第二章霍山石斛类原球茎组织培养系的建立

1.实验材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

2.实验方法

2.1 霍山石斛无菌苗的诱导

2.2 霍山石斛类原球茎的诱导

2.3 类原球茎增殖

2.4 霍山石斛类原球茎长期培养的品质稳定性考察

2.4.1 霍山石斛无菌苗的诱导

2.4.2 类原球茎总多糖单糖组成的稳定性

2.4.3 类原球茎的遗传稳定性

2.5 数据统计

3.实验结果

3.1 霍山石斛类原球茎的诱导

3.2 霍山石斛类原球茎的增殖

3.3 霍山石斛类原球茎的品质稳定性分析

4.讨论

第三章霍山石斛多糖增强机体免疫功能的研究

1.实验材料

1.1 霍山石斛

1.2 实验动物

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2.实验方法

2.1 HPS的提取及含量测定

2.2 HPS的DEAE-Cellulose分级分离

2.3 RPMI-1640培养液配制方法

2.4 HBSS液的配制

2.5 脾细胞悬液的制备

2.6 腹腔巨噬细胞悬液的制备

2.7 HPS联合Con A诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ

2.8 HPS联合LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α

2.9 总RNA的提取

2.10 RT-PCR

2.11 统计分析

3.实验结果

3.1 霍山石斛HPS的提取和蛋白脱除

3.2 野生霍山石斛HPS对小鼠脾细胞产生IFN-γ的影响

3.3 野生霍山石斛HPS对小鼠脾细胞IFN-γ mRNA表达的影响

3.4 野生霍山石斛HPS对小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的影响

3.5 野生霍山石斛HPS对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α mRNA表达的影响

3.6 野生霍山石斛HPS不同组分的活性

3.7 野生霍山石斛多糖与类原球茎多糖组分及生物学活性比较

4.讨论

第四章霍山石斛类原球茎液体培养碳氮代谢分析

1.实验材料

1.1 霍山石斛类原球茎

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2.实验方法

2.1 类原球茎悬浮培养与生长的测定

2.2 多糖提取和含量测定

2.3 可溶性糖含量的测定

2.4 蔗糖磷酸合成酶（SPS,EC 2.4.1.14）、蔗糖合成酶（SuSy,EC 2.4.1.13）和蔗糖酶（IT,EC 3.2.1.26）活性的测定

4⁺、NO₃^-的含量测定'>2.5 可溶性离子NH₄⁺、NO₃^-的含量测定

2.6 硝酸还原酶（NR,EC 1.6.6.1）、谷氨酸合酶（GOGAT,EC 1.4.1.14）和谷氨酰胺合成酶（GS,EC 6.3.1.2）活性的测定

2.7 实验参数

3.实验结果

3.1 霍山石斛类原球茎的生长动态进程

3.2 pH的动态变化

3.3 胞内、胞外糖消耗的动态进程

3.4 碳源代谢关键酶活性的动态变化

4⁺和NO₃^-消耗的动态进程'>3.5 胞内、胞外NH₄⁺和NO₃^-消耗的动态进程

3.6 氮源代谢相关酶活性的动态变化

4.讨论

第五章霍山石斛类原球茎生长和多糖合成调控

1.实验材料

1.1 霍山石斛类原球茎

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2.实验方法

2.1 类原球茎悬浮培养与生长的测定

2.2 生长培养基优化方案设计

2.3 多糖合成调节方案设计

2.4 多糖提取与含量测定

2.5 可溶性糖含量的测定

2.6 霍山石斛多糖的DEAE-Cellulose分级分离与含量测定

2.7 霍山石斛类原球茎多糖的生物学活性评价

2.8 实验参数

3.实验结果

3.1 类原球茎生长培养基的优化

3.1.1 碳源对类原球茎生长的影响

3.1.2 氮源对类原球茎生长的影响

2+、Fe²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺对类原球茎生长的影响'>3.1.3 Ca²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺对类原球茎生长的影响

3.2 HPS合成的调控

3.2.1 优化后霍山石斛类原球茎生长与多糖合成的动态分析

3.2.2 培养过程中补加蔗糖对类原球茎生长和HPS合成的影响

3.3 优化和调控条件下的HPS组分及生物活性评价

4.讨论

第六章霍山石斛活性多糖的分离纯化及结构表征

1.实验材料

1.1 霍山石斛类原球茎

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2.实验方法

2.1 HPS的提取和DEAE-Cellulose分级分离

2.2 HPS-1的凝胶渗透色谱纯化

2.3 多糖组分活性测定

2.4 多糖的纯度及摩尔分子量测定

2.5 HPS-1B23的比旋光度的测定

2.6 HPS-1B23的扫描电镜观察

2.7 刚果红实验

2.8 紫外光谱分析

2.9 HPS-1B23单糖组成成分分析

2.10 外光谱分析

2.11 高碘酸氧化反应

2.12 Smith降解反应

2.13 多糖甲基化分析

2.14 多糖的部分酸水解分析

2.15 多糖的核磁共振波谱分析

3.实验结果

3.1 霍山石斛多糖的凝胶柱色谱分离纯化

3.2 类原球茎多糖HPS-1B23纯度和分子量鉴定

3.3 类原球茎多糖HPS-1B23比旋光度的测定

3.4 类原球茎多糖HPS-1B23的表观形态学观察

3.5 刚果红实验分析

3.6 类原球茎多糖HPS-1B23紫外光谱分析

3.7 类原球茎多糖HPS-1B23单糖组成成分分析

3.8 类原球茎多糖HPS-1B23红外光谱分析

3.9 类原球茎多糖HPS-1B23相邻单糖连接方式的分析

3.9.1 高碘酸氧化和Smith降解分析

3.9.2 甲基化分析

3.9.3 核磁共振氢谱和碳谱分析

3.9.4 部分酸水解分析

4.讨论

第七章结论

攻读博士学位期间发表的研究论文及专利申请

濒危名贵药用霍山石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢