重组人载脂蛋白CⅡ在毕赤酵母中表达的研究

论文摘要

载脂蛋白（Apolipoprotein,Apo）是血浆中一组水溶性的低分子量蛋白质,是组成脂蛋白的蛋白质。载脂蛋白CⅡ（Apolipoprotein CⅡ, ApoCⅡ）作为脂蛋白脂酶（lipoprteinlipase,LPL）的辅助因子,是参与脂类代谢最重要的ApoC族的一个亚型,可激活多种来源的LPL,抑制肝脏对乳糜微粒（chylomicron lipoprotein, CM）和极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, VLDL）的摄取,维持脂蛋白（lipoprotein, LP）的稳定性,并参与血浆中LP残粒的清除过程,保护血管内皮细胞,在富含甘油三酯（triglyceride, TG）的LP分解代谢中具有重要的生物学功能,并在阻止高甘油三酯血症、动脉粥样硬化的形成方面发挥重要作用。本研究从人肝组织总RNA中钓取ApoCⅡcDNA序列,利用基因重组技术构建人ApoCⅡ克隆载体pMD18-T-ApoCⅡ及ApoCⅡ表达载体pPICZα-ApoCⅡ。将ApoCⅡ表达载体转化X-33毕赤酵母,建立兼具原核系统良好操作性和真核系统后加工性的重组ApoCⅡ毕赤酵母真核表达体系。通过PCR鉴定和重组ApoCⅡ蛋白SDS-PAGE分析筛选出高表达重组ApoCⅡ的酵母菌株。结果表明,本研究正确克隆了人ApoCⅡcDNA序列,构建的重组ApoCⅡ毕赤酵母真核表达体系经甲醇诱导可分泌重组ApoCⅡ蛋白,相对分子量为10kDa;重组的表达具有累积效应,产量在一段时间内随表达时间延长而增加;重组ApoCⅡ在毕赤酵母X-33中表达的最佳pH值为5.2左右。国内外文献未见相关报道。本研究为基因工程方法生产ApoCⅡ提供了实验依据。

论文目录

• 提要
• 英文缩略词
• 第一章 引言
• 第一节 载脂蛋白概述
• 第二节 ApocⅡ概述
• 一、ApocⅡ的结构与来源
• 二、ApocⅡ的生物学功能研究进展
• 三、ApocⅡ的基因表达与调解
• 四、ApocⅡ的临床应用
• 第三节 立题依据
• 第二章 人ApocⅡcDNA 的克隆
• 一、材料和方法
• （一）材料
• （二） 方法
• 二、结果
• 1. 人肝脏组织总RNA 的提取
• 2. RT-PCR克隆人ApocⅡ编码基因
• 3. 酶切鉴定重组载体pMD18-T-ApocⅡ
• 三、讨论
• 第三章 重组 ApocⅡ在毕赤酵母中的表达
• 一、材料和方法
• （一） 材料
• （二） 方法
• 二、结果
• 1. PCR 方法克隆 ApocⅡ编码基因
• 2. 酶切鉴定重组ApocⅡ表达载体
• 3. 重组质粒pPICZα-ApoCⅡ的序列测定
• 4. 阳性转化子的筛选
• 5. SDS-PAGE 鉴定重组ApoCⅡ
• 6. 毕赤酵母表达ApoCⅡ的最佳pH 值
• 三、讨论
• 1. 毕赤酵母表达体系的特点
• 2. ApoCⅡ表达载体的构建
• 3. 重组ApoCⅡ在毕赤酵母中的表达
• 第四章 结论与创新
• 一、通过本研究得出结论
• 二、本研究的创新之处
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢