费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL表达的改造对共生能力的影响及其在生态安全防范中的应用研究

论文题目: 费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL表达的改造对共生能力的影响及其在生态安全防范中的应用研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 谢波

导师: 周俊初

关键词: 费氏中华根瘤菌,基因,基因表达改造,生态安全防范,基因多效性,竞争结瘤,脂多糖,接合转移频率

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 根瘤菌的嘌呤合成途径在共生固氮过程中有重要作用，已知多数嘌呤缺陷型突变株都不能与宿主植物共生固氮。有报道认为嘌呤代谢途径中purL基因的转座子插入突变能导至腺嘌呤缺陷型和脂多糖LPS组分改变，该突变株与大豆只能形成微小无固氮活性的假瘤，虽在培养液中添加5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸或腺嘌呤和VB1可以提高突变株的结瘤能力，但仍不能恢复固氮功能。为进一步探讨purL基因对根瘤菌共生固氮能力的影响，并通过改造purL基因表达方式实现根瘤菌应用中的生态防范，本研究对purL基因进行了不同时间和水平的表达改造，以探讨菌株共生能力、竞争结瘤与purL基因表达的关系，并获得了既能有效共生固氮、又可较快消亡的共生诱导表达重组菌。此外，本研究还考察了PurL突变对其它生理过程的影响。 本研究通过对费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶purL的基因置换构建出腺嘌呤缺陷型突变株P825和P618，P825 purL的NotⅠ-ⅩhoⅠ片段被luxAB基因取代，P618的purL结构基因发生了1.98kb片段的缺失。两突变株只能在大豆上形成不固氮的假瘤，purL表达载体pBBR-PG在P825和P618中可恢复其在基本培养基上的生长情况和共生能力，同时对费氏中华根瘤菌SMH12、HN01、WH3和S11进行purL的基因置换，获得突变株SMH12-P1、HN01-P1、WH3-P1、S11-P1、SMH12-P2、HN01-P2、WH3-P2和S11-P2。 用fixK和fixR启动子启动purL表达的载体pHN801K和pHN801R，使P825仍需要添加腺嘌呤和VB1才能生长，在1％琼脂的基本培养基穿刺培养中，P825（pHN801R）和P825（pHN801K）有弥散性的生长，表明两启动子能够在微氧条件下启动purL的表达。而两种purL诱导表达重组菌只形成假瘤，均没有恢复共生固氮的能力。以purL-gusA转录融合单元构建出purL基因渗漏表达载体pHN811（1／3野生型、组成型表达水平）、含nifH、nifQ、fixN启动子的共生诱导表达载体pTPG-PnifH、pTPG-PnifQ、pTPG-PfixN和超量表达载体pBBR-PG（10倍野生型水平）。结果表明pHN811和适宜的共生诱导表达的pTPG-PnifH与pTPG-PnifQ都可使重组菌与大豆在无外源嘌呤添加物时建立有效的共生固氮体系。添加腺嘌呤和VB1，依然不能使突变株P618和purL不表达重组菌菌株P618（pTPG-PfixN）恢复共生固氮的功能，仅形成少数有侵染的无效根瘤。研究结果证明：只有表达了一定水平的purL基因才能进行有效侵染与共生固氮，而purL基因的表达在结瘤后期也是必需的。渗漏表达purL基因重组菌的现瘤时间晚于野生型2-3天，对植株鲜重和干重均、根瘤结构和含菌细胞中类菌体数量、固氮酶活的研究结果表明适宜的purL表达量对根瘤的正常发育和固氮效率发挥是必要的。 在植物砂培竞争结瘤实验中，purL基因渗漏表达、共生诱导表达和超量表达重组菌的竞争能力均显著下降，砂土盆载条件下重组菌的竞争能力均有所提高，添加

论文目录:

缩略语

摘要

Abstract

1.文献综述

前言

1.1 根瘤菌的形态,生理,营养与生存环境

1.2 根瘤菌的分类与互接种族关系

1.3 结瘤的早期过程与基因调控

1.3.1 根瘤菌的结瘤过程

1.3.2 结瘤基因及其表达调控

1.3.3 胞外多糖,脂多糖和荚膜多糖在共生过程中的作用

1.3.4 结瘤的宿主专一性

1.4 共生固氮体系的建立、功能与基因调控

1.4.1 根瘤的发育过程

1.4.2 共生固氮基因及其调控表达

1.4.2.1 共生基因与功能

1.4.2.2 共生基因的表达调控

1.4.3 根瘤中的代谢调控

1.4.3.1 碳代谢

1.4.3.2 氮代谢

1.4.3.3 代谢调控

1.5 影响共生固氮的几个重要因素与研究进展

1.5.1 根瘤菌的群体感应现象

1.5.2 结瘤的竞争性

1.5.3 嘌呤代谢途径

1.6 重组微生物和生态安全

1.6.1 转基因植物与动物

1.6.2 重组微生物

1.6.3 重组根瘤菌

1.6.4 生态安全

1.6.5 生态安全策略

1.6.5.1 管理制度

1.6.5.2 生态防范技术(Biological containment)

1.6.5.3 根瘤菌的生态防范

1.7 本研究目的

2.材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 抗生素与外源添加营养物质

2.1.4 试剂

2.2 方法

3.结果和讨论

3.1 费氏中华根瘤菌PurL~-突变株的构建

3.1.1 purL结构基因内Xhol-Notl片段置换为luxAB片段

3.1.1.1 基因置换载体pHN701的构建

3.1.1.2 费氏中华根瘤菌中purL基因的置换

3.1.1.3 purL组成型表达载体pBBR-PG的构建

3.1.1.4 突变株P825回复突变的验证

3.1.2 purL结构基因内1.98kb片段的缺失

3.1.2.1 基因置换载体pHN711的构建

3.1.2.2 突变株P618回复突变的验证

3.1.3 PurL突变株的共生性状

3.1.4 其它供试根瘤菌株PurL~-突变株的构建与筛选

3.1.5 小结与讨论

3.2 利用P_(fixK)和P_(fixR)对purL基因表达的改造

3.2.1 含共生特异性启动子P_(fixK)和P_(fixR)的purL诱导表达盒的构建

3.2.2 含共生诱导型表达盒P_(fixK)-purL和P_(fixR)-purL的重组根瘤菌生长状况的测定

3.2.3 含有共生诱导型表达盒P_(fixK)-purL和P_(fixR)-purL的根瘤菌共生能力

3.2.4 小结与讨论

3.3 利用报告基因gusA研究purL基因的时空表达

3.3.1 purL-gusA微弱表达载体pHN811的构建

3.3.2 purL-gusA共生诱导型表达载体pTPG-PnifH,pTPG-PfixN和pTPG-PnifQ的构建

3.3.3 HH103染色体上purL基因与外源purL-gusA融合单元的重组

3.3.4 purL基因表达水平对根瘤菌生长的影响

3.3.5 purL表达方式和水平对根瘤菌共生能力的影响

3.3.6 小结与讨论

3.4 purL基因表达方式对竞争结瘤和土壤存活能力的影响

3.4.1 重组菌株的竞争结瘤能力

3.4.2 重组菌株延迟共接种时的竞争结瘤能力

3.4.3 供试菌株在土壤中存活能力

3.4.4 小结与讨论

3.5 费氏中华根瘤菌PurL~-突变株与重组菌株的其它生物学特性研究

3.5.1 PurL~-突变株的脂多糖分析

3.5.2 purL基因渗漏表达对菌体形态的影响

3.5.3 PurL~-突变对菌株接合转移能力的影响

3.5.4 小结与讨论

4.总结和展望

参考文献

附录

发表文章

致谢

发布时间: 2006-12-12

参考文献

• [1].中国不同地区的山蚂蝗、甘草根瘤菌多相分类和系统发育研究[D]. 谷峻.中国农业大学2005
• [2].刺槐、黄檀、合欢根瘤菌的多相分类及系统发育研究[D]. 陈文峰.中国农业大学2002
• [3].合欢、金合欢和银合欢根瘤菌多相分类与系统发育研究[D]. 王风芹.中国农业大学2005
• [4].用多相分类确定分离自菜豆、杭子梢和决明的根瘤菌的分类地位[D]. 韩素贞.中国农业大学2002

相关论文

• [1].根瘤菌共生信号在豆科植物百脉根中的传递及其作用机制的研究[D]. 朱辉.华中农业大学2008
• [2].绿色荧光蛋白基因gfp在华癸中生根瘤菌与紫云英共生固氮体系研究中的应用[D]. 史巧娟.华中农业大学2000
• [3].费氏中华根瘤菌内源质粒间的相互作用及其对共生固氮的影响[D]. 缪礼鸿.华中农业大学2001
• [4].高效固氮重组大豆根瘤菌株的构建及其根圈定殖微生态学研究[D]. 李友国.华中农业大学2000
• [5].苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）LysR家族转录因子的功能研究[D]. 罗利.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2005
• [6].I 根瘤菌的遗传改造及其应用 II DNA超螺旋对nif基因表达的调节作用[D]. 刘彦杰.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2002
• [7].华癸中生根瘤菌7653R共生固氮相关基因的克隆与功能鉴定[D]. 程国军.华中农业大学2006
• [8].根瘤菌在植物内的迁移运动及其与植物相互作用的蛋白质组学研究[D]. 迟峰.中国科学院研究生院（植物研究所）2006
• [9].根瘤菌、铵态氮、光照强度对大豆固氮和光合作用影响的研究[D]. 周相娟.中国科学院研究生院（植物研究所）2006
• [10].华癸中生根瘤菌内源质粒间的相互作用及其对共生固氮的影响[D]. 胡国元.华中农业大学2006

标签：费氏中华根瘤菌论文;  基因论文;  基因表达改造论文;  生态安全防范论文;  基因多效性论文;  竞争结瘤论文;  脂多糖论文;  接合转移频率论文;