二氮嗪对窒息新生大鼠心肌线粒体保护作用机制研究

论文摘要

背景与目的新生儿窒息如未及时救治可引起各器官系统缺氧缺血损伤,而复苏后又可导致再灌注损伤,其中心脏、脑等器官对缺氧缺血/再灌注损伤较敏感,多种机制参与该过程。线粒体是细胞“能量工厂”,通过氧化磷酸化作用产生细胞生存所需90%的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）。近年来,人们对凋亡的认识已逐渐由细胞核为中心的调控模式转变为以线粒体为中心的调控模式,多种损伤机制最终通过影响线粒体功能导致心肌细胞凋亡或坏死,而线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放是缺血/再灌注导致线粒体损伤并最终致细胞死亡的关键性事件。近年研究发现,线粒体ATP敏感性钾离子通道（mitochodrial ATP-sensitive K+ channels,mitoKATP）开放对多种组织细胞缺氧缺血损伤有保护作用,参与了缺血预适应和缺血后适应心肌保护作用。对mitoKATP通道的深入研究发现,该通道与MPTP之间存在密切关系,但其相互作用机制仍未完全阐明。本研究以窒息诱发心肌缺氧缺血损伤的新生大鼠为研究对象,观察心肌损伤程度、心肌细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）表达量,检测心肌MPTP开放度、线粒体膜电位（ψm）变化、线粒体活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）生成量,并观察以特异性mitoKATP通道开放剂二氮嗪（Diazoxide）干预后心肌损伤程度以及线粒体功能的变化,以期阐明窒息新生大鼠心肌细胞MPTP开放度与心肌损伤之间的关系、mitoKATP通道开放剂对窒息后心肌细胞MPTP开放度的影响,并进一步阐述mitoKATP通道开放剂对缺氧缺血/再灌注损伤后心肌保护作用机制,为窒息后心肌损伤的治疗提供新策略。方法成年Sprague Dawley（SD）母鼠怀孕第21天行剖宫产,随机分为正常分娩组及动脉夹闭组,正常分娩组不夹闭子宫动脉,所分娩新生鼠为对照组;动脉夹闭组孕鼠以夹闭子宫动脉方法制作宫内窒息新生大鼠模型,再将存活新生大鼠随机分为窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组。对照组及窒息组新生鼠出生后不予任何药物干预,二氮嗪组在出生后腹腔注射mitoKATP通道开放剂二氮嗪3mg/kg,格列苯脲组在出生后腹腔注射二氮嗪3mg/kg及mitoKATP通道抑制剂格列苯脲300 g/kg,溶剂组在出生后腹腔注射药物溶剂0.1mM NaOH 0.5ml。每组各30只新生大鼠,于出生24h处死新生大鼠,10只取心脏血以酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTn I）,心肌组织用于分离线粒体,以荧光分光光度计检测MPTP开放度、线粒体ψm、ROS;10只取心肌组织切片以TTC染色方法检测心肌缺血面积;10只取心尖组织制作石蜡切片及超薄切片,以HE染色及电镜观察心肌细胞及线粒体形态变化、以免疫组化染色方法检测心肌组织AIF表达量。结果以均数±标准差（ x±s）表示,采用SPSS for Windows 13.0统计软件进行资料分析。结果对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠血清cTnI分别为0.08±0.04、0.40±0.29、0.10±0.04、0.33±0.17、0.34±0.20（ g/L）（P<0.01）,窒息组明显升高,二氮嗪干预后下降,格列苯脲组、溶剂组与窒息组相近。各组新生大鼠心肌组织切片以TTC染色观察心肌缺血面积,对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠心肌缺血面积分别为8.01±3.48、42.50±15.90、14.79±3.98、31.51±20.86、28.37±14.36（%）（P<0.01）,窒息组出现心肌点状坏死,二氮嗪干预后心肌缺血情况有所好转,接近正常组,格列苯脲组、溶剂组与窒息组相近。以HE染色观察新生大鼠心肌细胞损伤的病理改变,窒息组心肌细胞排列紊乱、细胞肿胀、部分细胞溶解,二氮嗪干预后心肌细胞肿胀有所减轻、排列好转,但尚未达正常,格列苯脲组及溶剂组结果与窒息组相近,格列苯脲抑制二氮嗪作用,溶剂对结果无影响。电镜观察窒息组心肌细胞核固缩、核崩解,线粒体空泡变性、外膜破裂、内膜肿胀,二氮嗪干预后线粒体空泡变性减少、线粒体肿胀较窒息组好转,格列苯脲组及溶剂组与窒息组结果相近。对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠心肌组织AIF阳性细胞比例分别为:9.70±3.06、77.50±11.81、44.60±17.49、70.70±14.36、73.60±15.19（%）（P<0.01）,窒息组较正常组明显升高,二氮嗪组表达下降,但仍较正常组高,格列苯脲组、溶剂组与窒息组差异无统计学意义;对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠MPTP分别为118.10±19.10、79.40±10.57、106.40±14.61、72.50±11.21、76.20±3.79 （RFU）（P<0.01）,ψm分别为1.61±0.08、2.01±0.09、1.86±0.15、1.96±0.27、2.10±0.29 （RFU）（P<0.01）,ROS分别为237.10±53.33、875.30±206.62、308.50±103.12、787.40±261.35、892.00±151.45 （RFU）（P<0.01）。窒息组心肌MPTP开放增多、膜电位下降、ROS生成增多,二氮嗪干预后MPTP开放度降低、ROS生成减少,格列苯脲组以及溶剂组结果均与窒息组相近;各组新生大鼠血清cTnI水平与心肌MPTP开放度（RFU）的相关系数r为-0.384 （P<0.01）,各组新生大鼠心肌AIF表达量与心肌MPTP开放度（RFU）的相关系数r为-0.725 （P<0.01）,由于RFU越小提示MPTP开放度越大,cTnI值、AIF值与RFU值呈负相关,则表示cTnI值、AIF值与MPTP开放度呈正相关。结论1.窒息新生大鼠出现心肌损伤,表现为血清cTnI升高、心肌缺血及坏死、AIF表达增高;并呈现心肌线粒体损伤,表现为心肌线粒体空泡变性、心肌MPTP开放度增大、线粒体膜电位下降、ROS生成增多,cTnI值、AIF值与MPTP开放度呈正相关,提示窒息后心肌MPTP开放度增大是导致心肌损伤的重要原因;2.窒息新生大鼠经mitoKATP通道开放剂二氮嗪干预后,血清cTnI升高程度下降、心肌缺血面积缩小、心肌线粒体形态改善、AIF表达下降,提示二氮嗪干预可保护心肌线粒体功能,从而减轻窒息后缺氧缺血性心肌损伤;3.窒息新生大鼠经二氮嗪干预后心肌MPTP开放度下降、ROS生成减少,该作用可被mitoKATP通道抑制剂格列苯脲拮抗,提示二氮嗪保护心肌线粒体的作用是通过开放mitoKATP通道而起效的,该通道开放可能通过降低线粒体ROS生成,从而抑制MPTP开放,减少线粒体释放AIF,起到保护线粒体功能的作用,但是否通过直接抑制MPTP开放起作用尚需进一步研究证实。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 第1章 前言
• 1.1 研究背景及意义
• 1.2 国内外研究概况
• 1.3 本课题来源及研究内容
• 第2章 正文
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验试剂与仪器
• 2.1.2 实验流程图
• 2.1.3 动物模型制作方法
• 2.1.4 动物分组及干预方案
• 2.1.5 检测内容及方法
• 2.1.6 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 各组新生大鼠出生后表现及死亡率比较
• 2.2.2 各组新生大鼠血清cTnI 值比较
• 2.2.3 各组新生大鼠心肌缺血面积比较
• 2.2.4 各组新生大鼠心肌组织HE 染色结果比较
• 2.2.5 各组新生大鼠心肌细胞超微结构变化比较
• 2.2.6 各组新生大鼠心肌细胞AIF 阳性率比较
• 2.2.7 各组新生大鼠心肌线粒体MPTP 开放度、膜电位、ROS 比较
• 2.2.8 各组新生大鼠心肌损伤程度与MPTP 开放度的关系
• 2.3 讨论
• 2.3.1 新生儿窒息及窒息后心肌损伤
• 2.3.2 新生儿窒息模型的制作以及心肌损伤的检测指标
• 2.3.3 窒息后心肌损伤与MPTP 的关系
• 2.3.4 窒息后心肌损伤与线粒体膜电位的关系
• 2.3.5 窒息后心肌损伤与线粒体ROS 关系
• 2.3.6 窒息后心肌损伤时MPTP 开放与AIF 关系
• ATP通道开放与MPTP 关系'>2.3.7 mitoK_ATP通道开放与MPTP 关系
• ATP通道开放与线粒体膜电位关系'>2.3.8 mitoK_ATP通道开放与线粒体膜电位关系
• ATP通道开放与线粒体ROS 关系'>2.3.9 mitoK_ATP通道开放与线粒体ROS 关系
• ATP通道开放剂对窒息心肌损伤的保护作用'>2.3.10 mitoK_ATP通道开放剂对窒息心肌损伤的保护作用
• 2.3.11 二氮嗪对窒息后多器官功能保护作用
• 2.3.12 本研究不足与进一步研究展望
• 第3章 结论
• 3.1
• 3.2
• 3.3
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 发表文章及本人简历
• 致谢