中国孤雌生殖卤虫胚胎发育相关基因的研究

论文摘要

卤虫（Artemia）属于甲壳纲（Crustasea）,鳃足亚纲（Branchiopoda）,无甲目（Anostacea）,卤虫科（Artemidae）,卤虫属（Artemia）,通常分布于内陆盐湖和海岸盐田中。本研究采用mRNA差异显示方法分离中国孤雌生殖卤虫早期胚胎发育相关基因。以发育0h、4h、8h、12h、16h和10d的中国孤雌生殖卤虫的总RNA为模板,用Oligod（T）13M（M分别为A、C、G）3种锚定引物和26种随机引物组合进行DDRT-PCR,经6%非变性PAGE凝胶电泳后,用硝酸银染色显示差异条带,共得到286条胚胎发育相关差异DNA片段,片段长度250—2000bp左右。对其中24条差异片段进行克隆测序,测序结果通过GenBank/EMBL/DDBJ/进行BLAST检索分析。结果发现Seq1、Seq2片断与已知基因有较高的同源性,其余片段与已知基因同源性较低。其中Seq1序列与编码罗非鱼的肌酸激酶基因有较高的同源性,517个碱基中有482个碱基是相同的,同源性达到了92%,Score=747,E=0。用BLASTX进一步比对表明:Seq1序列与罗非鱼的肌酸激酶有很高的同源性,部分序列同源性达到了88%,Score=300,E=3e-80。分离胶显示该基因在孤雌生殖卤虫胚胎发育至16h、10d时表达量增多。RT-PCR和测序结果进一步证明在卤虫胚胎发育至16h和10d时Seq1基因确实存在。Seq1为编码中国孤雌生殖卤虫肌酸激酶基因的一部分,该基因与中国孤雌生殖卤虫早期胚胎发育有着密切的关系。Seq2 BLAST分析表明与线虫丝氨酰tRNA合成酶有较高的同源性,100个氨基酸中有55个是相同的,Score=113,E=2e—24。Seq1和Seq2在胚胎发育中的具体作用还有待于进一步研究。其它同源性较低的片段可能为未知新基因,对这些序列信息进行进一步研究将有助于获得完整基因和了解中国孤雌生殖卤虫早期胚胎发育的机制。

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 卤虫相关基因的研究和生物学特征
• 1.1.1 卤虫相关基因的研究
• 1.1.2 卤虫分子生物学方面的研究
• 1.1.3 卤虫的生物学特征
• 1.1.4 卤虫研究存在的问题
• 1.2 克隆新基因的常用方法
• 1.2.1 序列克隆法
• 1.2.2 功能克隆法
• 1.2.3 cDNA文库的构建与全长cDNA的克隆
• 1.2.4 基因表达的序列分析
• 1.2.5 消减杂交和抑制消减杂交
• 1.2.6 外显子捕捉
• 1.2.7 mRNA差异显示
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 卤虫孵化及培养条件
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 总 RNA模板的纯化
• 2.2.3 RNA分子量和浓度的测定
• 2.2.4 反转录
• 2.2.5 PCR扩增和产物的凝胶电泳
• 2.2.6 硝酸银染色和差异条带的回收
• 2.2.7 成像
• 2.2.8 差异条带的回收
• 2.2.9 差异条带的再扩增
• 2.2.10 差异条带的纯化
• 2.2.11 差异片段的克隆
• 2.2.12 克隆片断的筛选
• 2.2.13 克隆片断的富集
• 2.2.14 质粒的提取
• 2.2.15 差异片段的测序
• 2.2.16 RT-PCR和测序验证
• 3 结果
• 3.1 总RNA的质量
• 3.2 差异显示PCR结果
• 3.3 序列结果及同源性分析
• 3.3.1 Seq1 Query=（866 letters）
• 3.3.2 Seq2 Query=（301 letters）
• 3.3.3 Seq3 Query=（626 letters）
• 3.3.4 Seq4 Query=（468 letters）
• 3.4 RT-PCR和测序验证
• 4 讨论
• 4.1 序列同源性比较结果的分析
• 4.1.1 序列结果的分析
• 4.1.2 同源性比较结果分析
• 4.2 差异显示方法的改进
• 5 结论
• Abstract
• 参考文献
• 致谢
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