氟苯尼考给猪肌注的药动学—药效学研究

论文摘要

药动学-药效学模型研究是抗菌药物合理应用的基础，对于全面反映药物、宿主及微生物三者之间的关系，评价药物疗效，制定最佳临床给药方案具有重要的理论和实际意义。目前对PK-PD模型研究较多的主要有四类药即β-内酰胺类药、氟喹诺酮类药、大环内酯类药和氨基糖苷类药，而对于氯霉素类，目前还未见报道。氟苯尼考是化学合成的第三代氯霉素类抗菌药物，是动物专用广谱抗菌药物，它克服了氯霉素具有抑制造血功能及再生障碍性贫血的缺点，同时增强了抗菌效果，其安全性和有效性均比氯霉素和甲砜霉素好。猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，是世界性规模化养猪的重要疫病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失。氟苯尼考是治疗猪传染性胸膜肺炎的首选药物，临床上应用广泛，但存在问题是滥用和误用现象严重，而滥用会导致猪胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼考产生耐药性，从而使临床治疗失败。药物的疗效与感染部位组织中的药物浓度直接相关，组织中要保证得到有效治疗浓度，氟苯尼考必须具有很好的组织穿透性，用组织笼考证氟苯尼考的组织穿透性。同时，药物是通过血液循环到达病变组织的，并且血清中药物浓度和猪胸膜肺炎放线杆菌的清除有更好的相关性。因此，本课题通过研究氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外药效学和氟苯尼考在猪体内的药动学，通过Hill方程把氟苯尼考对猪的药动学和药效学相结合，建立起氟苯尼考在猪血清和组织笼液的PK-PD模型，根据建立好的PK-PD模型来预测氟苯尼考治疗猪胸膜肺炎的合理给药方案，从而避免耐药性的发生，延长氟苯尼考治疗猪胸膜肺炎的寿命。采用微量稀释法测定氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。首先制备菌悬液，同时将氟苯尼考待测质量浓度设为128．00、64．00、32．00、16．00、8．00、4．00、2．00、1．00、0．50、0．25、0．125μg/mL，每个质量浓度设三个重复。通过96微孔板测定最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，以目测法找出始变澄清的第一孔，该孔中所含药物浓度，即为MIC，然后取高浓度液体培养物0．1ml接种于含小牛血清和辅酶1（NAD）的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂（TSA）平板上，37℃继续培养24h，以无菌落出现的最低药物浓度即为MBC。通过微量稀释法测得氯苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为0．5μg／mL和1μg/mL，表明氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌有很强的杀菌活性。依据最低抑菌浓度（MIC）结果采用1／2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC、64MIC的系列氟苯尼考浓度对猪胸膜肺炎放线杆菌做杀菌实验，在0、1、2、4、8、12、24h分别吸取0．1mL培养物涂于含有小牛血清和辅酶1的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂平板上，37℃孵育18h后进行菌落计数，并以不同时间点菌落数的常用对数绘制杀菌曲线。通过杀菌实验结果，从杀菌曲线上可明显看出氟苯尼考随着浓度的增加，氟苯尼考的杀菌活性增大，表明氟苯尼考属于浓度依赖性抗菌药物。选取5mL塑料离心管，在其表面打孔，制成组织笼，灭菌烘干。选择20～25kg健康仔猪，以盐酸普鲁卡因进行局部麻醉，于耳后颈部两侧皮肤以无菌手术分别切开皮肤形成一2～3cm的小口，露出肌肉，向下方钝性分离肌肉和皮肤，使肌肉和皮肤之间形成一个空腔，然后植入组织笼并缝合切口。五周后组织笼感染模型建好。以20mg／kg体重肌注氟苯尼考，分别于0、15、30min及1、1．5、2、3、4、6、9、12、15、24、36、48h采集血清并于0、1、3、6、9、12、15、24、36、48h采集组织笼液，用气相色谱-微电子捕获检测技术测得各点血清和组织笼液中氟苯尼考的浓度。结果表明：猪肌注氟苯尼考后的血药经时过程和组织笼液经时过程均符合一室开放模型，主要药物动力学参数如下：血清中吸收半衰期T1／2Ka为1．50±0．76h，消除半衰期T1／2Kb为11．16±3．36h，AUC为24．76±5．36h*μg/mL，Tmax为2h，Cmax5．93±1．63μg／mL；组织笼液中穿透半衰期T1／2Kpen为4．62±1．19h，消除半衰期T1／2Kb为17．35±0．57h，AUC为49．09±7．04h*μg/mL，Tmax为12h，Cmax为3．20±0．89μg／mL。从半衰期可以看出氟苯尼考在血清中吸收很快，氟苯尼考从血清中渗透到组织笼中的速度很慢且氟苯尼考在组织笼液中的消除较慢。微量稀释测定0、1、3、6、9、12、15、24、36、48h的血清和组织笼液的间接杀菌活性。从间接杀菌曲线结果可知：血清中1、3、6h氟苯尼考有很强的杀菌活性，孵育24h后几乎所有的细菌都被杀死，9h时氟苯尼考有较弱的抑菌活性，而12、15、24、36、48h的氟苯尼考没有抑菌活性。组织笼液中氟苯尼考在6、9、12、15、24h氟苯尼考有很强的杀菌活性，孵育24h后几乎所有的细菌都被杀死，3h时氟苯尼考有较弱的抑菌活性，而1、36、48h的氟苯尼考没有抑菌活性。采用WinNonlin软件对药动学和药效学数据拟合知氟苯尼考在猪体内的PK-PD模型为S形Emax模型即Hill模型。通过Hill方程处理ex vivoAUC24h／MIC值与抗菌疗效之间的关系，可知血清中AUC24h／MIC为23．69时，开始有抑菌作用，AUC24h／MIC为24．33时能抑制50％的细菌生长，AUC24h／MIC为25．96时能抑制99．9％的细菌生长，AUC24h／MIC为52．33时能够彻底清除病原菌的生长。在组织笼液中当AUC24h／MIC为22．38时开始有抑菌作用，AUC24h／MIC为25．31时能抑制50％的细菌生长，AUC24h／MIC为26．34时能抑制99．9%的细菌生长，AUC24h／MIC为51．64时能够彻底清除病原菌的生长。利用公式（?）可知要想取得抑菌效果，临床最低给药剂量为10．95mg/kg。综上所述，本课题首次阐明了氟苯尼考的PK-PD特性即氟苯尼考属于浓度依赖性抗菌药物，具有浓度依赖性抗菌药物的共性，其PK-PD参数为AUC／MIC和Cmax／MIC，同时通过WinNonlin软件拟合药动学和药效学数据得氟苯尼考在猪体内的PK-PD模型为S形Emax模型，并确定了氟苯尼考治疗猪胸膜肺炎的临床给药剂量。研究结果为避免临床上滥用和误用氟苯尼考提供了依据，从而可以减少细菌耐药性的发生，并在一定程度上为养殖户节约成本。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究内容和目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 药品与试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 动物
• 2.4 菌种及菌液配制
• 2.5 培养基配制
• 2.6 氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌实验
• 2.6.1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定
• 2.6.2 杀菌曲线的制作
• 2.7 氟苯尼考在猪血清和组织笼液中定量分析方法建立
• 2.7.1 色谱条件选择
• 2.7.2 样品制备
• 2.7.3 特异性和专一性考核
• 2.7.4 最低检测限与定量限确定
• 2.7.5 标准曲线和工作曲线的绘制
• 2.7.6 准确度和精密度测定
• 2.8 猪组织笼感染模型的建立
• 2.9 氟苯尼考在猪体内的药物动力学实验
• 2.10.1 猪胸膜肺炎放线杆菌的计数
• 2.1 0.2 细菌的生长曲线测定
• 2.10.3 氟苯尼考的ex vivo杀菌动力学曲线测定
• 2.11 氟苯尼考在猪血清和组织笼液的PK-PD关系的建立
• 2.11.1 数据处理
• 2.11.2 PK-PD参数临界点值（breakpoint）的确定
• 2.11.3 给药方案的预测
• 3 结果
• 3.1 氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌效果
• 3.2 定量分析方法学结果
• 3.2.1 特异性和专一性
• 3.2.2 最低检测限和最低定量限
• 3.2.3 标准曲线和工作曲线
• 3.2.4 准确度和精密度
• 3.3 氟苯尼考在猪血清中和组织笼液中的药物动力学参数
• 3.4 氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌EX VIVO杀菌活性
• 3.4.1 细菌生长规律
• 3.4.2 氟苯尼考的ex vivo杀菌动力学特点
• 3.5 氟苯尼考在猪血清和组织笼液的PK-PD模型的建立
• 4 讨论
• 4.1 猪胸膜肺炎放线杆菌的保存
• 4.2 氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌杀菌活性
• 4.3 定量方法学选择依据
• 4.3.1 色谱柱的选择
• 4.3.2 检测器的选择
• 4.3.3 色谱条件的选择
• 4.3.4 样品处理方法的选择
• 4.4 组织笼感染模型的优势
• 4.5 氟苯尼考在猪体内的药物动力学特征
• 4.6 PK-PD模型在推荐临床给药剂量中的应用
• 4.6.1 PK-PD参数和PK-PD模型的选择
• 4.6.2 根据PK-PD模型推荐治疗猪胸膜肺炎的最佳给药方案
• 5 结论
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录
• 答辩委员主要问题的回答