液态发酵生产菜籽ACE抑制肽的研究

论文摘要

菜籽ACE（血管紧张素转化酶）抑制肽是指将菜籽蛋白水解成为3-6个氨基酸的小肽,它可以通过抑制ACE的活性来实现降血压作用,相比于合成的ACE抑制剂药物具有安全性高,副作用少,易吸收的特点,是目前国内外生物活性肽研究的热点。利用食品级的枯草芽孢杆菌直接水解菜籽蛋白,可以降低菜籽ACE抑制肽的生产成本,加速菜籽ACE抑制肽的产业化进程。因此,枯草芽孢杆菌生产菜籽ACE抑制肽是一种具有广泛应用前景的方法,此方法在国内外尚未有相关报道。本论文进行了以下四方面的研究:（1）液态发酵法制备菜籽ACE抑制肽菌种的筛选;（2）液态发酵的培养基条件优化;（3）液态发酵的发酵条件优化;（4）菜籽ACE抑制肽的分离纯化。研究结果如下:（1）采用枯草芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,黑曲霉,白地霉,产朊假丝酵母,宇佐美曲霉、雅致放射毛霉对菜籽粕进行液态发酵,以氮溶解指数、SN-TCA,氨基酸态氮、肽得率和ACE抑制活性为评价指标,对液态发酵生产菜籽ACE抑制肽的菌种进行筛选。结果表明:在上述菌种中枯草芽孢杆菌液态发酵所得肽得率最高,并且具有最高的ACE抑制活性,菌种优势明显,是液态发酵菜籽粕生产ACE抑制肽的优势菌种。（2）以菜籽粕为原料,通过枯草芽孢杆菌液态发酵生产菜籽ACE抑制肽。先以肽得率、ACE抑制率为指标通过单因素试验得到液态发酵的培养基条件,再以响应面分析法,优化枯草芽孢杆菌液态发酵培养基中的3种成分,确定枯草芽孢杆菌发酵生产菜籽肽的最佳培养基工艺条件为:磷酸二氢钾0.45%、葡萄糖0.8%、料液比1:23,初始pH7。优化后的ACE抑制率理论值可达69.3%。（3）在培养基条件优化的基础上,对液态发酵的工艺条件进行了进一步的优化。先以肽得率、ACE抑制率为指标通过单因素试验得到液态发酵的发酵条件,再以响应面法分析法,优化了枯草芽孢杆菌液态发酵的工艺条件,确定枯草芽孢杆菌液态发酵生产菜籽ACE抑制肽的最佳发酵工艺条件为发酵时间,发酵温度和接种量,最佳工艺条件分别为20 h、38℃和1×108个/mL。优化后的菜籽ACE抑制肽抑制率达到70.95%。（4）将制备得到的菜籽多肽液进行超滤膜分离,凝胶色谱分离,离子交换色谱分离和反向高效液相色谱分离,结果表明:发酵菜籽肽经截留分子量3KD的超滤后,具有较高的ACE抑制性,超滤菜籽肽分别经凝胶过滤色谱分离后,得到5个主要峰,其中R-D（300da）的ACE抑制活性最高,达到73.5%,将R-D使用离子交换色谱分离,得到3个主要峰,其中R-D-B的ACE抑制活性最高,为78.2%,将R-D-B经过反相液相色谱分离后得到纯度较高的ACE抑制肽R-D-B-B,其ACE抑制活性达到88.9%,为较纯肽段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 ACE 抑制肽作用机理
• 1.2 ACE 抑制肽的结构特点与功能性质
• 1.3 菜籽ACE 抑制肽的制备
• 1.3.1 菜籽ACE 抑制肽的酶法制备
• 1.3.2 发酵法制备菜籽ACE 活性肽
• 1.4 菜籽ACE 抑制肽的测定和分离方法
• 1.4.1 菜籽ACE 抑制肽的测定方法
• 1.4.2 菜籽ACE 抑制肽的分离
• 1.4.3 菜籽ACE 抑制肽的序列测定
• 1.5 菜籽ACE 抑制肽的研究前景和展望
• 1.6 研究目的、内容及拟解决的关键技术
• 1.6.1 本研究目的
• 1.6.2 主要研究内容
• 1.6.3 拟解决的关键技术
• 第二章 液态发酵法制备菜籽ACE 抑制肽菌种的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同菌种液态发酵对氮溶解指数的影响
• 2.2.2 不同菌种发酵菜籽蛋白对其SN-TCA 指数的影响
• 2.2.3 不同菌种发酵对菜籽蛋白氨基酸态氮影响
• 2.2.4 不同菌种发酵对菜籽蛋白肽得率的影响
• 2.2.5 不同菌种发酵对菜籽蛋白ACE 抑制活性的比较
• 2.3 结论
• 第三章 液态发酵法制备菜籽ACE 抑制肽培养基条件优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.1.3 方法
• 3.1.4 数据处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线
• 3.2.2 肽含量标准曲线
• 3.2.3 培养基葡萄糖浓度对肽得率和ACE 抑制率的影响
• 2PO₄ 浓度对肽得率和ACE 抑制率的影响'>3.2.4 培养基KH₂PO₄ 浓度对肽得率和ACE 抑制率的影响
• 3.2.5 培养基料液比对肽得率和ACE 抑制率的影响
• 3.2.6 培养基pH 值对肽得率和ACE 抑制率的影响
• 3.2.7 响应面分析法优化发酵条件结果分析
• 3.3 结论
• 第四章 液态发酵法制备菜籽ACE 抑制肽发酵条件的优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要仪器与设备
• 4.1.3 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 摇床转速对液态发酵肽得率和ACE 抑制率的影响
• 4.2.2 接种量对液态发酵肽得率和ACE 抑制率的影响
• 4.2.3 发酵温度对液态发酵肽得率和ACE 抑制率的影响
• 4.2.4 发酵时间对液态发酵肽得率和ACE 抑制率的影响
• 4.2.5 响应面分析法优化发酵条件结果分析
• 4.3 结论
• 第五章 液态发酵生产菜籽ACE 抑制肽的分离纯化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要仪器与设备
• 5.1.3 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 超滤菜籽多肽的ACE 抑制率
• 5.2.2 菜籽ACE 抑制肽的凝胶色谱分离
• 5.2.3 菜籽ACE 抑制肽的离子交换分离
• 5.2.4 菜籽ACE 抑制肽的反相液相色谱分离
• 5.3 结论
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 致谢