RNAi抑制bcr/abl融合基因表达及其对K562细胞的影响

论文摘要

慢性粒细胞白血病（CML）是起源于多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病。95％的CML具有ph染色体，该染色体是由于9，22号染色体易位导致的t（9；22）（q34；q11）。22号染色体bcr基因的N端与9号染色体abl基因的C端（外显子2-11）联结在一起形成bcr／abl融合基因，编码210KD的癌蛋白。与内源性的abl（p120）相比，bcr／abl（p210）具有持续的酪氨酸激酶活性。体外细胞株及动物实验结果表明，p210对于CML的发病是必需的。P210使细胞增殖增加，凋亡受阻和粘附缺陷。因此，bcr／abl融合蛋白在揭示CML的分子病理机制及治疗中有重要意义，并为临床治疗提供了新的靶点。新兴的RNA干扰技术是一种由双链RNA诱导的基因沉默现象，它可以降解特定的mRNA，使之无法翻译成蛋白质，从而抑制特定基因的表达。Elbashir等证实在细胞内诱导RNAi作用的实际上是一些21-23个核苷酸的短小双链RNA（small interfering RNAs，siRNAs），并且在体外转入哺乳动物细胞后，同样可以使特定基因的表达受到有效抑制。该方法是一种高效的、特异的研究基因功能的技术，并有可能成为一种有效的基因治疗手段。本研究应用特异的针对bcr／ablmRNA的siRNA，在mRNA水平阻断bcr／abl的表达，观察阻断融合基因表达后肿瘤细胞生长和增殖的改变，并研究对融合基因部分相关下游转导信号的影响，进一步探讨bcr／abl融合基因在慢性粒细胞白血病形成中的作用和可能的分子机制，为临床提供一种可能的靶向治疗手段。本研究分为以下四个部分：第一部分实时定量RT-PCR检测bcr／abl融合基因的方法建立及临床应用稳定建立了以TaqManTM技术原理为基础的实时定量RT-PCR技术检测慢性粒细胞白血病bcr／abl mRNA的方法，探讨CML bcr／abl融合基因的表达水平与临床疗效的关系。该方法可同时检测b2a2和b3a2两种亚型，GAPDH的mRNA作为内参照，检测了14例CML患者22个样本的融合基因表达水平，并动态观察了2例异基因造血干细胞移植（Allo-Hematopoietic Stem Cel Transplantation，Allo-HSCT）复发后bcr／abl mRNA表达量与临床疗效的关系。国内尚未见类似报道。Bcr／abl及GAPDH标准曲线的相关系数均为0.999；灵敏度为10-6；14例初诊患者的mRNA表达水平范围为2.81～145；2例异基因造血干细胞移植后复发患者的bcr／abl mRNA表达水平的改变与临床疾病进展关系相一致；CML患者骨髓和外周血bcr／abl表达水平一致。实时定量RT-PCR检测CML患者的bcr／abl融合基因敏感可靠、重复性好，有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效、判断疾病预后及指导临床治疗。第二部分siRNA对bcr／abl融合基因表达的特异性阻断RNA干扰技术是一种由双链RNA诱导的基因沉默现象，它可以降解特定的mRNA，使之无法翻译成蛋白质，从而抑制特定基因的表达。Heidenreich已采用RNAi技术成功抑制了具有t（8；21）易位的AML1／MTG8融合基因的表达，mRNA抑制率达50％～80％，AML1／MTG8融合蛋白也有相应的下降。目前国内多通过siRNA表达载体、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA等进行RNAi研究。化学合成法虽成本昂贵，但特异性好，抑制效率高。我们首先尝试采用体外化学合成的siRNA进行抑制血液系统恶性肿瘤特定基因表达的相关研究，国内尚未见报道。针对CML bcr／abl融合基因位点体外化学合成siRNA-S序列，转染稳定表达bcr／abl融合蛋白的K562细胞。比较电穿孔与脂质体转染悬浮培养细胞的方法的可行性及转染效率，在体外化学合成的双链siRNA分子5′端标记荧光分子用以确定转染效率，属国内领先。应用实时荧光定量RT-PCR、Western blots检测siRNA片段对bcr／abl mRNA和蛋白表达的抑制作用。以具有三个位点突变的siRNA序列（siRNAmut）为对照检测RNAi作用的特异性。我们观察到：电穿孔可有效转染siRNA至K562细胞，转染效率在70％以上，高于脂质体转染法（50％～60％）。FAM标记的siRNA不适合应用于电穿孔转染效率的监测。SiRNA-S可抑制K562细胞bcr／abl融合基因的表达，虽然转染入细胞内的siRNA会随转染浓度的增加而增加，但抑制作用不会随之增加。SiRNA-S的最佳作用剂量为200nM，作用效果短暂，最佳作用时间为48小时。实时荧光定量RT-PCR和Western blos检测结果显示，siRNA-S可导致bcr／abl mRNA下降约67％（转染24小时）和72％（转染48小时），同时伴随有bcr／abl蛋白表达下降，但对abl mRNA和蛋白的表达无影响。转染siRNAmut对K562细胞中bcr／ablmRNA和蛋白表达均无明显影响，说明siRNA-S具有高度的序列专一性和有效的干扰活力。国外只有Scherr及Wilda等人进行了此方面的相关研究，我们的实验结果与之基本一致。实验证明，siRNA可特异、有效地抑制bcr／abl融合基因的表达，为研究bcr／abl基因功能及其下游信号提供了有效方法；亦为临床自体造血干细胞移植前造血干细胞的体外净化提供了颇具前景的方法；siRNA稳定、不需要化学修饰、用量低且抑制率高，有可能解决传统反义核酸技术基因治疗的难题。第三部分RNAi对K562肿瘤细胞生长和增殖的影响Bcr/abl融合蛋白在体外可导致多种细胞系的转化，对维持肿瘤细胞的生长、增殖也有重要的作用。SiRNA阻断bcr／abl融合基因表达后，K562细胞生物学特性可能会发生相应改变。应用台盼蓝拒染法和MTT法检测siRNA对肿瘤细胞增殖的影响，应用Annexin V-FITC，DNA Ladder等方法检测肿瘤细胞的凋亡。转染含点突变的siRNAmut序列为对照检测其对肿瘤细胞的影响，以空白转染组作对照检测转染方式的非特异细胞毒性作用。实验发现，转染siRNA-S的细胞经台盼蓝拒染和MTT检测后，显示其可短暂抑制K562细胞的增殖：出现典型的DNA Ladder改变：AnnexinV-FITC染色显示，K562细胞在转染siRNA-S后死亡与凋亡的比例共为42.10％（24小时）和53.33％（48小时），其中凋亡比例只占有15.05％（24小时）和19.47％（48小时）。RNAi后，K562细胞死亡比例随凋亡比例升高而明显升高，分别为27.05％（24小时）和33.86％（48小时），而对照组和siRNA-Smut组分别仅为0.63％和4.55％。提示siRNA-S可抑制肿瘤细胞生长；不仅诱导肿瘤细胞的凋亡，还导致肿瘤细胞的死亡。SiRNAmut则无明显的抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡及死亡的作用。说明siRNA-S对K562细胞增殖的抑制作用特异且有效。Wohlbold等人发现K562细胞在转染dsRNA 48小时后的细胞生物学的变化是凋亡率增高。我们不但观察到SiRNA-S转染K562细胞后凋亡的增加，而且观察到K562细胞的死亡也明显增加。进一步证实bcr／abl融合基因的表达对维持CML肿瘤细胞的分裂和增殖具有重要作用。第四部分RNAi对bcr／abl相关下游信号转导分子的影响具有酪氨酸激酶活性的bcr／abl融合蛋白已被证实与细胞的增殖分化相关。但肿瘤的发生发展的分子机制是相当复杂的，可能涉及了许多细胞信号分子。目前发现的可能与bcr／abl相关的信号传导系统有RAS途径和JAK／STAT途径等，siRNA干扰后会通过哪些分子和信号转导通路影响细胞的生物学活性尚不清楚，也未见到相关文献报道。JAK／STAT信号途径在大多数表达bcr／abl的细胞系中被活化，而JAK2和STAT5在CML的发病机制中起重要作用。故本研究应用Western blots检测RNAi干扰前后的JAK2与STAT5表达水平的变化。实验结果显示，转染siRNA-S的K562细胞较未转染的细胞相比，JAK2及STAT5蛋白表达水平明显降低。转染点突变的siRNAmut序列与未转染的细胞比较，JAK2与STAT5蛋白表达水平均无明显改变。证明siRNA-S抑制bcr／abl融合基因表达后，进一步抑制JAK2／STAT5通路的激活，从而降低肿瘤细胞的抗凋亡作用，进而可能产生其它生物学效应。进一步证实，JAK／STAT是bcr／abl重要的下游信号分子，为CML的基因治疗提供了新的潜在治疗靶点。综上所述，本研究首先建立了可临床应用的敏感可靠的实时定量RT-PCR检测bcr／abl融合基因的技术。应用针对bcr／abl融合蛋白特异、有效的siRNA抑制bcr／abl融合基因的表达。从而抑制了K562肿瘤细胞的增殖，除使肿瘤细胞凋亡增加，死亡也明显增加。为进一步研究探讨bcr／abl功能、CML靶向治疗及自体造血干细胞的体外净化提供了有效的方法；同时检测干扰后相关信号分子表达水平的改变，进一步证实了JAK／STAT信号通路是bcr／abl融合蛋白作用的关键分子之一，为CML提供潜在的新治疗靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分:实时定量RT-PCR检测bcr/abl融合基因的方法建立及临床应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:siRNA对bcr/abl融合基因表达的特异性阻断
• 前言
• 第一节 转染方法的筛选与转染效率的比较
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 siRNA对bcr/abl融合基因mRNA及蛋白表达的阻断作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 RNAi对K562细胞生长和增殖的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 RNAi对bcr/abl相关下游信号转导分子的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文参考文献
• 致谢
• 已发表论文
• 综述一:bcr/abl基因表达的定量检测技术及临床意义
• 综述二:RNA干扰的研究进展及临床应用前景
• Inhibitory effect of RNAi on expression of bcr/abl oncogene in K562 cells