穿膜肽携带的目的蛋白穿膜效应的研究

论文摘要

生物大分子在许多疾病的治疗中发挥着重要作用,如超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT）、VEGF、糖尿病特效药胰岛素、抑癌基因表达的抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞凋亡的抑瘤蛋白p53、p27等。由于细胞膜的天然屏障作用,只有分子量小于600Da的小分子化合物、非极性疏水性的、脂溶性的,或细胞膜上有其载体的有机物才能穿透细胞膜进入细胞内。使得这类有治疗价值但无细胞膜穿透性且易降解的亲水性分子在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大大受到限制。多年来,研究人员致力于探索将这些效应分子导入活细胞的有效方法。常用的方法有电穿孔、显微注射、改变大分子物质的物理和化学性状、基因转染、颗粒（如脂质体）包裹法和细胞融合技术等。尽管这些方法各有优势,但都存在着操作复杂、效率不高和难于调控等问题。近年来,相继发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列,长度为几个至几十个氨基酸不等,多数小于20个氨基酸,被命名细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides,CPPs）。细胞穿膜肽也被称之为蛋白转导域（protein transduction domain,PTD）,或Trojan horse peptides,可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式,导入多种哺乳动物细胞,且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。CPPs的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光,在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类,细胞穿膜肽的研究始于1988年,Green和Frankel分别证实HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1997年,Vives等发现HIV-TAT中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白转导功能密切相关天然存在的CPPs。目前已经发现的有三种,分别来自果蝇同源异型域ANTP、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）VP22转录因子以及HIV-1和SIV（2,3）的Tat。这些细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段,其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基。利用这一特性,人工合成的多聚精氨酸、赖氨酸,也具有穿膜活性,且9个精氨酸和9个赖氨酸残基构成的基序比Tat PTD的蛋白转导活性还要强。经过对天然存在的CPPS的结构研究Morris小组设计合成了21个氨基酸残基的兼性肽段PEP-1 （KETWWETWWTEWSQPKKKRKV）,PEP-1不同于天然CPPs,无需共价键与目的大分子相连即可发挥转运外源大分子的作用,可以转运天然构像蛋白高效进入细胞,这大大改善了以往的CPPs只能高效转运变性蛋白的缺憾。绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）由238个氨基酸组成,分子量为27kD,在395nm波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光,它的表达没有种属特异性,不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助,灵敏度高。在多数细胞GFP发出的荧光可以均匀地充满胞浆、细胞核和诸如轴突的远端突起。GFP在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察,加之动物体内不产生内源性GFP,它是活细胞的理想标记物,可以在荧光显微镜下直接对活体细胞进行研究。由于其荧光稳定、检测方便、对活细胞无伤害等,已被作为报告蛋白在检测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面被广泛应用。增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescence protein,EGFP）是GFP的突变体,是由GFP的第64、65位的苯丙氨酸和丝氨酸分别置换成亮氨酸和苏氨酸而形成[23],EGFP在480nm波长的激发下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光,使得其观察和检测更为方便灵敏。p27基因是Polyak等于1994年发现的一种抑癌基因,其在肿瘤发生发展和治疗方面的作用正不断被发现。正常情况下p27基因在GO/G1期表达增高,当细胞进入S期表达下降。p27基因编码的P27蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子（CKIs）,是细胞周期的负调控因子,能作用于整个细胞周期,广泛抑制各种细胞周期素和CDK的活性,具有负调控细胞周期进程、参与细胞分化的调控、诱导细胞凋亡等作用。除此之外P27还可调节实体瘤的耐药性,防止炎症对机体的损伤。P27被广泛应用于各种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等治疗的试验研究,P27的降解主要由泛素介导的187位苏氨酸磷酸化引起,半衰期较短（约2h）,在体内不稳定,因此p27kipl被称为“短寿蛋白”。Kudo等研究发现将187位的苏氨酸置换成丙氨酸,p27蛋白将不被泛素激活,蛋白降解明显降低。Jean等将p27转染HeyC2细胞,发现细胞生长明显抑制。本研究使用的p27mt是将天然存在的p27（也称野生型p27wt）编码187位苏氨酸和188位脯氨酸的cDNA序列ACGCCC突变为ATGATC,翻译的氨基酸相应的置换成蛋氨酸和异亮氨酸,突变后的P27mt因失去187位苏氨酸活性基团羟基而不能被磷酸化,半衰期延长,能更紧密的结合CDK-cyclin复合物,预示P27mt具有更强的抑癌作用。作为一个含198个氨基酸27KD大小的蛋白质,P27mt很难穿透脂质双分子的细胞膜并在细胞内达到一定的浓度。本课题分为三个部分第一部分:TAT-EGFP融合蛋白对小鼠生物膜穿透性的研究人工合成编码HIV-TAT PTD11个氨基酸的双链寡核苷酸片段,PCR扩增目的基因EGFP,分子克隆常规操作构建pET28a-TAT-EGFP重组表达载体,转导入宿主菌BL21后用IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,经镍金属鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。通过腹腔注射到小鼠体内,观察TAT-EGFP融合蛋白穿透各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。研究发现腹腔注射TAT-EGFP,30min后各主要脏器经检测均有荧光出现,4h各组织荧光强度达最大值。研究证明HIV-1TAT-PTD与EGFP形成的融合蛋白可穿透包括脑组织在内的所有生物膜。这一结果为TAT携带其他生物大分子穿透生物膜的研究提供了一个良好的报告蛋白,同时为生物大分子应用于临床治疗开辟了广阔的前景。第二部分PEP-1-EGFP穿透性研究人工合成编码PEP-1 21个氨基酸的两条寡核苷酸片段,PCR扩增目的基因EGFP,利用T/A克隆,构建pGEM-T-EGFP重组质粒,分子克隆常规操作构建pETl5b-pep-1-EGFP重组表达载体,转导入宿主菌E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导PEP-1-EGFP融合蛋白表达,经镍金属鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。在体外培养细胞及小鼠体内研究融合蛋白的穿透性。实验证明pGEM-T Easy载体的使用使基因克隆过程更加简便容易,构建更加准确无误。EGFP的N端加上PEP-1这一人工合成的CPPs形成的融合蛋白,可以无需经过复杂的变性复性过程,直接以天然有活性的形式穿透体外培养细胞及小鼠各组织器官。这一研究为使用更加安全有效的穿膜肽奠定了良好的实验基础,为使用天然构像的EGFP研究活细胞结构、功能提供了一个良好的报告蛋白。第三部分:PEP-1-P27mt的穿透性研究人工合成编码细胞穿膜肽PEP-1 21个氨基酸的双链寡核苷酸片段,构建pETl5b-pep-1-p27mt重组表达子,转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）pLysS宿主菌,IPTG诱导,高效表达可溶性PEP-1-P27mt融合蛋白,利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”,Ni2+-金属鳌合树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定纯化目的蛋白。在体外培养的食管癌EC9706细胞加入不同浓度的PEP-1-P27mt并作用不同时间,免疫荧光观察加入PEP-1-P27mt 10min培养细胞即出现荧光染色,2h染色光密度达到最高峰,PEP-1-P27mt终浓度为1nmol/L促细胞凋亡作用最强。SD大鼠腹腔注射PEP-1-P27mt后,免疫荧光检测发现30min各主要脏器均有荧光出现,4h各组织荧光强度达最大值。实验证明PEP-1能有效携带P27mt进入培养细胞及动物体内,为应用P27mt抑制肿瘤细胞生长,治疗肿瘤提供了一种新的生物学方法。

论文目录

• 主要缩写词
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 前言
• 第一部分 TAT-EGFP小鼠生物膜穿透性的研究
• 中、英文摘要
• 一 材料与方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 第二部分 PEP-1-EGFP生物膜穿透性研究
• 中、英文摘要
• 一 材料与方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 第三部分 PEP-1-P27mt的穿透性研究
• 中、英文摘要
• 一 材料与方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录:博士期间发表主要文章
• 致谢