白喉毒素突变体CRM197的表达纯化及性质研究

论文摘要

疫苗根据技术特点分为传统疫苗和新型疫苗。多糖结合疫苗则属于新型疫苗的一种。多糖结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性。国内研制的结合疫苗多采用类毒素，但类毒素作为载体可诱导产生全身及局部免疫反应，具有粘膜佐剂作用，但具有局限性。因为，用福尔马林或戊二醛脱毒的类毒素，会改变其自身的蛋白结构，可能破坏了重要的T细胞抗原位点，会影响其免疫原性。而且，体内存在的类毒素抗体可能影响结合疫苗的免疫应答。故现在研究的最多的蛋白载体是CRM197。CRM197（cross reacting material197）是白喉毒素的一种突变体，它的第52位氨基酸由Gly突变为Glu，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，从而不能对细胞产生毒性作用，但在抗原性和免疫原性上仍与天然的白喉毒素保持一致。因此本实验利用基因工程技术在大肠杆菌中对CRM197进行诱导表达，经纯化后，将重组蛋白CRM197作为载体，研究了它与肺炎链球菌荚膜多糖结合的可行性，并对其免疫原性进行了初步研究。首先，根据GenBank中白喉毒素的基因序列（登录号：CQ967258），进行密码子优化，加强分泌型信号肽，合成基因。同时设计引物，运用PCR技术扩增不含信号肽的CRM197基因。构建两组质粒pBAD-DEST49/CRM197和*pBAD-DEST49/CRM197。双酶切鉴定后，转入大肠杆菌中进行诱导表达。结果显示，分泌型菌株中的重组蛋白CRM197一部分存在于细胞间隙，一部分以包涵体形式存在细胞质内。其次，对表达的蛋白分开纯化。分泌到细胞间隙的蛋白，通过增强细胞壁的通透性，让细胞间隙中的蛋白释放出来。对于包涵体形式的蛋白，破碎菌体离心后取沉淀。经过蛋白质变性复性等一系列步骤后，过DEAE阴离子柱，可使重组蛋白CRM197纯度达到95%以上。通过免疫印迹法验证重组CRM197的活性，结果显示重组蛋白CRM197具有良好的抗原性。最后，用溴化氰活化肺炎链球菌荚膜多糖，以ADH作为连接剂，以重组蛋白CRM197作为蛋白载体，在EDAC的作用下制备肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197结合物。通过免疫双扩散试验证明结合物能分别与肺炎链球菌血清和白喉抗毒素产生沉淀线，说明结合物偶联成功，并具有良好的抗原性。本研究应用基因工程技术获得了能表达重组蛋白CRM917的工程菌菌株，并将纯化后的重组蛋白CRM197与肺炎链球菌荚膜多糖偶联，制成了肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197结合物。为进一步以重组CRM197为载体蛋白，制备其它结合疫苗奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略表
• 第一章 前言
• 1.1 结合疫苗的前景
• 1.1.1 细菌多糖
• 1.1.2 载体蛋白
• 1.2 肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197 结合疫苗
• 1.3 本课题的选题依据和研究意义
• 第二章 CRM197 载体质粒的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要溶液配制方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因的设计
• 2.2.2 目的基因的扩增
• 2.2.3 目的基因和载体的连接
• 2.2.4 连接产物的转化与筛选
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 目的基因的克隆和序列分析
• 2.3.2 双酶切后得到的目的基因 CRM197 片段和载体 pBAD-DEST49 片段
• 2.3.3 筛选阳性菌株
• 2.3.4 重组质粒 pBAD-DEST49/CRM197 的双酶切鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 重组蛋白 CRM197 的表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 主要溶液配制方法
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组 CRM197 在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.2.2 SDS-PAGE 电泳
• 3.2.3 重组目的蛋白表达形式鉴定
• 3.2.4 目的蛋白表达量和诱导表达时间的关系
• 3.2.5 不同培养基对目的蛋白表达量的影响
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 重组蛋白 CRM197 的诱导表达
• 3.3.2 重组蛋白表达形式的鉴定
• 3.3.3 目的蛋白表达量和诱导表达时间的关系
• 3.3.4 不同培养基对目的蛋白表达量的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 重组蛋白 CRM197 的纯化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要溶液配方
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 重组蛋白的分离纯化
• 4.2.2 重组蛋白浓度测定（Lowry 法）
• 4.2.3 重组蛋白的活性鉴定 （Western Blotting）
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 重组蛋白的表达纯化
• 4.3.2 重组蛋白浓度测定（Lowry 法）
• 4.3.3 重组蛋白的活性鉴定 （Western Blotting）
• 4.4 讨论
• 第五章 重组蛋白与肺炎链球菌荚膜多糖的结合
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 仪器与设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 肺炎链球菌荚膜多糖衍生物的制备
• 5.2.2 肺炎链球菌荚膜多糖衍生物的检测
• 5.2.3 肺炎链球菌多糖-重组 CRM197 结合物的制备
• 5.2.4 结合物的理化性质测定
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 肺炎链球菌荚膜多糖衍生物的检测
• 5.3.2 肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197 结合物理化性质检测
• 5.4 讨论
• 第六章 结论、创新点、存在的问题及进一步工作设想
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 存在问题及进一步工作设想
• 参考文献
• 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明
• 致谢