慢性阻塞性肺疾病中转录因子ATF3/ATF4和KLF2在Nrf2/γ-GCS通路中的作用及意义

论文摘要

【目的】研究转录因子ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2及γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠及患者肺组织中的表达变化关系;探讨ATF3、ATF4、KLF2与Nrf2蛋白之间的相互作用,以及对γ-GCS-HS基因表达的影响;探索它们在COPD发病中的可能作用,为COPD的防治提供新的理论依据。【方法】实验分两部分。（1）动物试验部分:将22只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组和COPD模型组,每组11只。采用每日熏香烟和两次气管内滴入脂多糖（LPS）复制COPD大鼠模型。检测各组大鼠肺功能并观察大鼠肺组织病理形态学改变;原位杂交和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺组织ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA的表达。免疫组化和免疫印迹（Western blot）分别检测ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达水平。并同时利用免疫共沉淀法（CO-IP）探讨ATF3、ATF4、KLF2与Nrf2蛋白之间的相互作用。（2）临床试验部分:肺癌患者手术切除肺组织标本40例,所有患者术前均询问病史,进行体检、X线胸片或肺部CT和肺功能检测,其中COPD组和对照组各20例。原位杂交分析各组患者肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA水平,免疫组化检测肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白的表达。【结果】1.动物试验结果（1）大鼠肺功能指标（FEV0.3、FEV0.3/FVC%、PEF）在COPD组较对照组明显降低（P均<0.01）。COPD组大鼠肺部病理改变符合COPD的形态学改变。（2） ROS含量在COPD组较对照组显著增高（P<0.01）,γ-GCS-HS活性在COPD组较对照组显著升高（P <0.01）。（3）原位杂交结果显示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA在两组大鼠肺组织中的表达部位基本一致,主要见于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、平滑肌细胞以及血管内皮细胞,且ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA在COPD组显著高于对照组（P均<0.05）但两组Nrf2 mRNA比较无明显差异（P >0.05）。RT-PCR结果与原位杂交结果一致。（4）免疫组化结果显示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS主要表达于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞,小血管平滑肌中亦有少许表达。ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2在COPD组以胞核表达为主,γ-GCS-HS在胞浆胞核均有免疫着色,其差异具显著性（P均<0.05）。Western blotting结果与免疫组化结果一致（P均<0.05）。（5）免疫共沉淀显示:在Nrf2抗体捕获的免疫沉淀中,ATF3、ATF4、KLF2抗体均可杂交出明显的蛋白条带,且COPD组明显增强（P<0.01）。（6） SPSS16.0软件行直线相关分析:大鼠肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2蛋白表达与γ-GCS-HS mRNA、蛋白及酶活性均呈正相关（均P <0.05）;ATF3、ATF4、KLF2蛋白表达与Nrf2蛋白表达均呈正相关（均P <0.05）;ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2蛋白表达与ROS呈正相关（均P <0.05）。2.临床试验结果（1） COPD患者肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA呈强阳性表达,较对照组显著升高（均P <0.01）,而Nrf2 mRNA在两组肺组织中均呈阳性表达,两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。（2） ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白在COPD患者肺组织中呈强阳性表达,较对照组明显增高（均P < 0.01）。（3） SPSS16.0软件行直线相关分析:ATF3、ATF4、KLF2蛋白表达与Nrf2蛋白、γ-GCS-HS mRNA及蛋白表达均呈明显正相关（均P <0.01）,而与Nrf2 mRNA表达无明显相关性（P >0.05）。另肺组织中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表达与FEV1（%）、FEV1/FVC（%）均呈正相关（均P <0.01）。【结论】1.在COPD氧化应激状况下,体内重要抗氧化酶γ-GCS可代偿性上调,而Nrf2是γ-GCS表达上调的关键性转录调控子,可增加GSH合成,降低ROS,对抗氧化损伤。2.在慢性阻塞性肺疾病发病过程中,氧化应激诱导转录因子ATF3、ATF4过表达可能与Nrf2的转录调控有关。3. ATF3、ATF4可与Nrf2形成异二聚体,可能通过增加Nrf2的转录活性,上调γ-GCS mRNA和蛋白质的表达而发挥抗氧化保护作用。4. KLF2可能通过增加Nrf2的表达,活化并促进Nrf2核积聚,上调γ-GCS mRNA和酶活性表达,对抗氧化应激。

论文目录

• 主要缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 硕士期间撰写论文
• 致谢