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AVM诱导王鸽脑神经细胞凋亡的线粒体通路研究

2020-12-01阅读(911)

AVM诱导王鸽脑神经细胞凋亡的线粒体通路研究

论文摘要

阿维菌素（avermectin,AVM）是农业和畜牧业中大量应用的具有潜在环境毒性的农畜两用杀虫剂,目前已被认为是抗蠕虫药物中环境毒性最为严重的药物之一。以往研究表明AVM能引起中毒动物运动失调,脑组织出血和水肿以及脑神经细胞凋亡等变化,但尚未见到深入系统的研究,对于神经细胞凋亡途径的研究也较少,AVM诱导体外培养神经细胞线粒体凋亡途径的研究尚未见报道。鉴于鸽子为环境监测推荐的试验动物,本课题以体外培养王鸽脑神经细胞为研究对象,进行2.5μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1三种不同剂量AVM的染毒处理,通过对王鸽脑神经细胞的存活率、细胞的形态学变化、生化特征变化、LDH漏出率、NO产生量;线粒体活性、线粒体膜电位、线粒体氧化应激、细胞内游离钙离子浓度及细胞内CaM mRNA表达、细胞内Caspase酶活性以及Caspase-3 mRNA表达等凋亡影响因素的观察,探讨了AVM对神经细胞毒性作用的剂量效应关系,以阐述AVM对神经细胞影响的线粒体机制。研究结果表明:1.应用AO-EB双荧光染色、HE染色、透射电镜以及Tunel法,观察培养液中添加三种不同剂量AVM对神经细胞毒性作用,从形态学角度证实AVM能够引发神经细胞凋亡,且神经细胞凋亡指数与培养液中添加AVM的剂量呈正相关。2.应用琼脂糖凝胶电泳、酶标仪、流式细胞术等方法,观察培养液中添加三种不同剂量AVM对神经细胞的DNA损伤以及磷脂酰丝氨酸（PS）的影响情况,从生化特征角度证实了AVM能够引发神经细胞凋亡,神经细胞的膜对称性消失,且影响程度与培养液中添加AVM剂量有关。3.通过检测神经细胞的LDH漏出率和NO产生量,证实AVM能引起神经细胞的膜通透性增加,NO产生量减少。4.采用四唑盐比色法（MTT法）观察AVM对神经细胞的线粒体活性的影响,结果表明培养液中添加三种不同剂量AVM均能使神经细胞线粒体活性降低,且神经细胞线粒体活性变化与培养液中添加AVM的剂量呈正相关,证实AVM能损伤神经细胞的线粒体。5.应用流式细胞术观察线粒体膜电位和细胞内活性氧（ROS）的产生情况,结果显示培养液中添加三种不同剂量AVM均能引起神经细胞氧化应激,线粒体膜电位下降,证实AVM通过氧化应激损伤线粒体介导细胞凋亡。6.应用半定量RT-PCR法和比色法检测Caspase-3 mRNA表达水平和Caspase-3、8、9活性,结果显示AVM能够引起细胞内Caspase-3 mRNA表达水平上升,Caspase-3活性增加,Caspase-9活性也增加,Caspase-8在AVM浓度为2.5μg·L-1时活性增强,其它剂量组变化不明显,证实AVM可通过线粒体途径激活Caspase酶系统导致神经细胞凋亡。7.应用半定量RT-PCR法和荧光探针法检测细胞内CaM mRNA表达水平和游离钙离子浓度,结果表明AVM能够引起鸽神经细胞内CaM mRNA表达水平下降,游离钙离子浓度升高,干扰细胞钙离子的转运,导致细胞钙稳态失衡,证实AVM能通过影响细胞内钙稳态损伤线粒体介导细胞凋亡。本试验从细胞毒性、细胞凋亡、氧化应激、线粒体膜电位、线粒体活性、钙稳态以及凋亡蛋白酶等角度入手,在细胞形态,生化特征和分子水平上阐明了AVM毒性作用的线粒体机制,为揭示AVM中毒的发病机制提供新的思路和见解,在充实AVM生态毒理学资料的同时,也为进一步深入研究AVM对生物影响提供有价值的线索,并为保护生态环境和合理应用阿维菌素类药物提供科学依据。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  • 1.1 阿维菌素的概述
  • 1.2 阿维菌素的毒性作用
  • 1.3 阿维菌素与细胞凋亡
  • 1.4 细胞凋亡线粒体调控机制的研究进展
  • 1.4.1 线粒体通透性转换孔（MPTP）与细胞凋亡
  • 1.4.2 线粒体膜电位（ΔΨm）与细胞凋亡
  • 1.4.3 线粒体细胞色素C 与细胞凋亡
  • 1.4.4 线粒体Smac 因子与细胞凋亡
  • 1.4.5 线粒体AIF 与细胞凋亡
  • 1.4.6 线粒体ATP 与细胞凋亡
  • 1.4.7 线粒体与凋亡抑制基因（Bcl-2）
  • 1.4.8 线粒体产生活性氧与细胞凋亡
  • 2+与细胞凋亡'>1.4.9 线粒体、Ca2+与细胞凋亡
  • 1.4.10 细胞凋亡的线粒体途径与Caspase 家族
  • 1.5 试验的目的与意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 主要仪器与材料
  • 2.1.1 主要仪器
  • 2.1.2 主要试剂
  • 2.1.3 试验药品
  • 2.1.4 试验材料
  • 2.2 王鸽脑神经细胞原代分离培养、纯化及处理
  • 2.2.1 神经细胞原代分离培养、纯化
  • 2.2.2 神经细胞的鉴定
  • 2.2.3 分离纯化的神经细胞的处理
  • 2.3 不同剂量AVM 致神经细胞毒性的检测
  • 2.3.1 AVM 干预后的神经细胞形态学观察
  • 2.3.2 AVM 干预后的神经细胞生化特征观察
  • 2.3.3 AVM 对神经细胞存活率影响的检测
  • 2.3.4 AVM 对神经细胞培养上清液中LDH 释放率的检测
  • 2.4 不同剂量AVM 致神经细胞线粒体毒性的检测
  • 2.4.1 线粒体膜电位的检测
  • 2.4.2 线粒体活性的检测
  • 2.4.3 细胞内活性氧水平检测
  • 2.4.4 细胞内NO 含量和NOS 活性的检测
  • 2+]i 浓度的检测'>2.4.5 细胞内[Ca2+]i浓度的检测
  • 2.4.6 Caspase-3、8、9 活性的检测
  • 2.4.7 半定量RT-PCR 测定神经细胞CaM 和Caspase-3 mRNA 的表达
  • 2.5 试验数据分析与统计
  • 3 试验结果
  • 3.1 培养不同时期的神经细胞的形态学观察结果
  • 3.2 神经细胞尼氏体染色结果
  • 3.3 不同剂量AVM 致神经细胞毒性的检测结果
  • 3.3.1 AVM 诱导神经细胞凋亡的形态学变化的检测结果
  • 3.3.2 AVM 诱导神经细胞凋亡生化特征变化的检测结果
  • 3.3.3 AVM 对神经细胞相对存活率影响的检测结果
  • 3.3.4 AVM 对神经细胞内LDH 释放率影响的检测结果
  • 3.4 不同剂量AVM 致神经细胞线粒体毒性的检测结果
  • 3.4.1 AVM 致神经细胞Δψm 变化的检测结果
  • 3.4.2 AVM 对神经细胞线粒体活性影响的检测结果
  • 3.4.3 AVM 对神经细胞ROS 形成的影响的检测结果
  • 3.4.4 AVM 对神经细胞内NO、NOS 和iNOS 影响的检测结果
  • 2+]i 影响的检测结果'>3.4.5 AVM 对神经细胞内[Ca2+]i影响的检测结果
  • 3.4.6 AVM 对神经细胞Caspase 酶活性的检测结果
  • 3.4.7 AVM 对神经细胞CaM、Caspase-3 mRNA 表达影响的检测结果
  • 4 讨论
  • 4.1 王鸽神经细胞分离、纯化培养及鉴定
  • 4.2 不同剂量AVM 对神经细胞的影响
  • 4.2.1 AVM 对神经细胞的形态学影响
  • 4.2.2 AVM 对神经细胞生化特征的影响
  • 4.2.3 AVM 对神经细胞相对存活率的影响
  • 4.2.4 AVM 对神经细胞培养上清液中LDH 释放率的影响
  • 4.3 不同剂量AVM 对神经细胞线粒体的毒性影响
  • 4.3.1 AVM 对神经细胞线粒体活性、Δψm 和ROS 变化的影响
  • 4.3.2 AVM 对神经细胞内NO、NOS 和iNOS 影响
  • 2+]i 和CaM mRNA 表达的影响'>4.3.3 AVM 对神经细胞内[Ca2+]i 和CaM mRNA 表达的影响
  • 4.3.4 AVM 对神经细胞Caspase 蛋白酶及Caspase-3 mRNA 表达的影响
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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