论文摘要
白血病（Leukemia）是人体造血组织的恶性疾病，也是儿童期发病率最高的一种恶性肿瘤疾病，是五岁以下儿童死亡的主要原因之一，白血病的发生、发展与细胞凋亡（Cell apoptosis）异常有密切关系，凋亡是一种基因（Gene）指导下的细胞主动自我消亡过程，它是正常胚胎发生过程和成人组织器官发育中细胞清除的正常途径，当凋亡通路受到抑制或阻断就可以使细胞永生化而恶变。凋亡涉及到一系列的基因调控（Gene regulation），促进凋亡的基因有Bax、p53家族等。凋亡理论的提出不仅为白血病病因和发病机制开辟了新的领域，而且为白血病的治疗提供了新的思路。现知许多治疗白血病的传统化疗药物如柔红霉素（Daunorubicin）、甲氨蝶呤（Methotrexate）等都能够通过诱导白血病细胞发生凋亡而起到治疗白血病的作用，化疗几乎是治疗白血病的唯一选择。以儿童急性淋巴细胞白血病为例，二十世纪40年代后期主要局限于寻找有效的单一化疗药物，缓解和生存率很低，二十世纪50年代及60年代初发展了联合化疗和维持治疗。五年无病生存率达10％～20％，此后由于治疗白血病新药的问世，五年无病生存率已经达到50％～80％，近年许多细胞因子的出现为白血病的治疗提供了新的策略。为探索某些细胞因子和化疗药物对白血病细胞生长的影响，本研究以急性髓细胞白血病细胞（acute myeloid leukemia，AML）株DAMI细胞为靶细胞通过CCK-8法、流式细胞仪及免疫组化法对细胞增殖、早期凋亡指标、细胞周期及P73基因的表达进行检测，探讨单独或联合应用重组人白血病抑制因子（recombinant human leukemia inhibitory，rh-LIF）和柔红霉素对DAMI细胞的增殖与凋亡的影响，阐明有关机制，为白血病的临床治疗提供理论和实验依据。方法：将DAMI细胞置于含体积分数为10％小牛血清的RPMI1640培养基中，37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。应用细胞增殖实验观察不同浓度的rh-LIF，DNR及两者联合应用对DAMI细胞作用6h、12h、24h、48h后细胞株增殖及活力的变化，用流式细胞仪测早期凋亡指标Annexin V，免疫组化法检测用药前后P73蛋白的表达变化、通过细胞周期测定来分析细胞发生凋亡的周期。全部数据用SPSS13.0统计软件进行处理，结果用均数±标准差（（?）±s）表示。方差齐时用两组间的均数比较用t检验，方差不齐时两组间的均数比较用秩和检验，检验水准a=0.05。结果：1不同浓度的rh-LIF（1，5，10，20，40 ng/ml）对DAMI细胞株作用于6h、12h、24h、48h后，观察细胞株的增殖变化，当rh-LIF浓度较低时（1ng/ml）对细胞的增殖抑制作用不明显（P>0.05），而当rh-LIF浓度增高（≥5ng/ml）时，对细胞的增殖抑制作用增强，差异有显著性意义（P<0.05），流式细胞仪测定早期凋亡指标发现浓度为1 ng/ml时凋亡不明显（P>0.05），≥5 ng/ml时凋亡率增高（P<0.05），随着rh-LIF浓度的逐渐增高p73蛋白的阳性表达率也明显增高，差异有显著性意义（P<0.05），p73蛋白的阳性表达率与药物浓度和作用时间呈一定的相关。细胞周期分析显示多数细胞被阻滞于G0/G1期。2不同浓度的DNR（0.5，1，2，4，8μmol/L），对DAMI细胞株作用于6h、12h、24h、48h后观察细胞株的增殖变化，浓度0.5μmol/L时抑制作用不明显（P>0.05），1，2，4，8μmol/L时，随着浓度加大、时间的延长抑制作用越越明显，差异有显著性意义（P<0.05）。0.5μmol/L时细胞开始发生凋亡，在0.5，1，2μmol/L时细胞随着作用时间的延长凋亡率显著增高（P<0.05），4，8μmol/L时凋亡率则有下降趋势。0.5，1，2μmol/L时免疫组化显示p73蛋白的阳性表达率增高。4，8μmol/L时p73蛋白的阳性表达率降低。细胞周期分析显示DNR作用于DAMI细胞后被阻滞于G0/G1期。3 rh-LIF与DNR联合作用于DAMI细胞株对细胞增殖的抑制、细胞凋亡率的变化所示比单用rh-LIF的作用强（P<0.05），与单用DNR相比无明显差别、p73蛋白阳性表达率与单用rh-LIF或DNR相比阳性表达率低（P<0.05），细胞周期分析显示rh-LIF与DNR联合作用于DAMI细胞后被阻滞于G0/G1期。结论：1．rh-LIF和柔红霉素可抑制DAMI细胞株的生长，呈浓度、时间依赖性；p73蛋白的高表达可能是诱导DAMI细胞株凋亡的机制之一。2．细胞因子rh-LIF联合化疗药物无明显协同诱导DAMI细胞凋亡的作用。