沙雷氏菌FS14（Serratia sp.FS14）中两种分泌蛋白的分离纯化及相关特性的研究

论文摘要

本实验室前期从病害白术茎秆中分离得到了一株沙雷氏菌FS14,研究发现,该菌株能分泌耐高温的DNA酶和蛋白水解酶。这是首次发现沙雷氏菌能分泌耐高温的DNA酶和蛋白水解酶。本试验的初旨在于分离鉴定出耐热的DNA酶,并对其进行研究。为了得到相关的耐热的DNA酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素柱层析和Superdex G-200分子筛层析等多种纯化步骤,我们纯化出了胞外两种分泌量及纯度均较高的蛋白,它们的分子量分别约为50Ku和40Ku。其中50Ku的蛋白经检测后发现其具有耐高温的DNA酶活性。然而将分离纯化后的50Ku蛋白经质谱测定氨基酸序列后发现,该蛋白为一种金属蛋白酶（MetalloProtease）.因此我们随后测定了该蛋白的蛋白酶活性,结果发现此蛋白的确具有耐高温的蛋白酶活性,而且具有较宽的酸碱耐受性。这说明该蛋白可能不仅具有DNA酶活性,还具有蛋白酶活性。为了更进一步验证上述结果,我们根据沙雷氏菌属中同源金属蛋白酶基因的序列设计了一对引物,采用PCR方法从沙雷氏菌FS14的基因组DNA中扩增出金属蛋白酶成熟肽编码区的DNA序列。并将含有金属蛋白酶成熟编码区基因的重组质粒pET24b-50Ku,转化至表达宿主大肠杆菌C43（DE3）中。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳结果显示在预期蛋白大小一致（50Ku）的位置出现了一条多余的条带,但进一步的研究发现该蛋白完全以包涵体的形式存在于细胞内。为了获得有活性的目的蛋白,我们对该包涵体蛋白进行了变性、复性,并成功地获得了复性的蛋白。复性后的蛋白经SDS-PAGE检测显示与预期分子量大小一致,酶活性检测亦发现复性后的样品具有蛋白酶活性和DNA酶活性。此外,我们还将该50Ku金属蛋白酶的活性催化位点第174为谷氨酸突变成丙氨酸,研究发现该突变体仍具有DNA酶活性,但不具有蛋白酶活性。综合结果我们确认该50Ku蛋白为一种双功能蛋白,具有DNA酶活性和蛋白酶活性。将分子量约为40Ku的蛋白进行氨基酸序列测定,经比对分析确认该蛋白为鞭毛蛋白。由于同一个属,不同种的沙雷氏菌鞭毛蛋白中间肽段氨基酸序列的变化很大,但C、N端的氨基酸序列则高度保守,因此我们根据粘质沙雷氏菌SM6中鞭毛蛋白的编码基因的两端序列设计了一对引物,扩增出编码该蛋白的基因。该基因经测序后进行序列比对,我们发现该基因序列推导的氨基酸序列与所报道的鞭毛蛋白氨基酸序列同源性最高有83%的氨基酸序列完全相同。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词
• 引言
• 文献综述
• 一、沙雷氏菌属的研究进展
• 1. 沙雷氏菌属的简介
• 2. 沙雷氏菌胞外分泌物的研究概况
• 二、金属蛋白酶的研究进展
• 1. 金属蛋白酶基本介绍
• 2. 微生物金属蛋白酶结构
• 3. 金属蛋白酶基因的克隆及表达
• 4. 微生物金属蛋白酶的应用
• 5. 沙雷氏菌分泌的金属蛋白酶的研究概况
• 三、核酸酶的研究概况
• 1. 沙雷氏菌中核酸酶研究进展
• 四、鞭毛蛋白的研究概况
• 五、双功能蛋白的研究概况
• 第一章 沙雷氏菌菌株FS14中DNA酶的分离纯化及其特性的研究
• 摘要
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 表达载体
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 酶和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DNA酶的分离、纯化
• 1.2.2 DNA酶活性测定
• 1.2.3 质谱法测定DNA酶的氨基酸序列
• 1.2.4 蛋白酶活性的测定
• 1.2.5 50Ku金属蛋白酶基因的克隆、表达
• 1.2.6 包涵体的变性、复性及纯化
• 1.2.7 复性后50Ku金属蛋白酶DNA酶活的检测
• 1.2.8 温度对复性后50Ku金属蛋白稳定性的影响
• 1.2.9 50Ku金属蛋白酶突变体E174A（50E174A）的克隆、表达
• 1.2.10 50E174A包涵体的变性、复性及纯化
• 1.2.11 复性后50E174A DNA酶活检测
• 1.2.12 温度对复性后50E174A稳定性的影响
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 DNA酶的分离、纯化
• 1.3.2 50Ku蛋白DNA酶活性的检测
• 1.3.3 纯化的50Ku蛋白的氨基酸序列的测定
• 1.3.4 50Ku金属蛋白酶蛋白酶活性的检测
• 1.3.5 50Ku金属蛋白酶基因的克隆及测序
• 1.3.6 50Ku金属蛋白酶基因的诱导表达
• 1.3.7 50Ku金属蛋白酶的表达产物的存在形式的确定
• 1.3.8 50Ku金属蛋白酶包涵体变性、复性及纯化
• 1.3.9 经包涵体复性后的50Ku金属蛋白酶DNA酶活的检测
• 1.3.10 温度对复性后50Ku金属蛋白酶蛋白稳定性的影响
• 1.3.11 50Ku金属蛋白酶突变体（50E174A）的构建
• 1.3.12 50Ku金属蛋白酶突变体（50E174A）基因的表达
• 1.3.13 50E174A的表达产物的存在形式的确定
• 1.3.14 50E174A包涵体变性、复性及纯化
• 1.3.15 经复性后50E174A DNA酶活性检测
• 1.3.16 温度对50E174A稳定性的影响
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 沙雷氏菌FS14中鞭毛蛋白的分离、纯化及其基因的克隆、测序鉴定
• 摘要
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 40Ku蛋白的分离、纯化及质谱鉴定
• 2.2.2 鞭毛蛋白基因的克隆、测序
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 40Ku蛋白的分离、纯化及质谱鉴定
• 2.3.2 鞭毛蛋白基因（fla）的克隆、测序
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 全文总结
• 研究的主要创新点
• 参考文献
• 附录一 文中所用试剂配方
• 附录二 有关核苷酸序列
• 附录三
• 附录四
• 致谢