日本结缕草（Zoysia japonica Steud.）悬浮再生体系的建立与超低温保存研究

论文摘要

以日本结缕草（Zoysia japonica Steud）品种‘Zenith’和来源于山东和辽宁的野生材料‘Liaoning’、‘Shandong’为试验材料,进行了悬浮体系建立、体胚诱导和遗传转化和超低温保存的研究,以期建立起高频再生体系,并对体系进行长期稳定的保存,为结缕草细胞工程和基因工程奠定了理论和实践基础。主要成果如下:1.建立并优化日本结缕草悬浮体系。淡黄色、颗粒状、结构松散的胚性愈伤组织适合悬浮培养,悬浮培养基是液体MS2（MS+2 mg/L2,4-D）。初期,条件培养基与新鲜培养基比例以1:3为宜。同一克隆的愈伤组织,随着继代次数的增加,体系建立需要的时间变短。2.显微观察发现,悬浮培养前期,散出细胞多为长条形具有明显的大液泡;随着时间的延长,椭圆形细胞逐渐增多,细胞内颗粒状的内含物逐渐增多;悬浮体系建立后,细胞为椭圆形,细胞质浓厚,无明显的大液泡,内含物丰富。3.悬浮体系的生长曲线分为滞后期、对数生长期、静止期和衰亡期。接种密度以5～7 ml（PCV）/100 ml为宜,培养周期为7天。最适宜悬浮体系生长的pH值范围是5.5～6.2。4.建立了日本日本结缕草体胚诱导、再生体系。液体MS培养基和固体MS培养基均能诱导体胚的产生。但液体诱导的体胚难以进一步分化。固体再生培养,两个月后获得再生植株。以Zenith品种的胚性悬浮体系Clone A、Clone B和非胚性悬浮体系Clone J为试验材料进行了玻璃化法、快速冰冻法和干燥法超低温保存研究,建立了悬浮细胞保存体系。取得以下进展:1.胚性悬浮细胞系冻存后细胞存活率大于非胚性细胞悬浮系;预培养可以显著的提高细胞存活率,预培养后适当的干燥处理也可以提高细胞存活率;过渡处理显著地降低细胞存活率;冻后细胞37～40℃水浴快速解冻后培养。2.玻璃化法冻存同一克隆不同生长时期的细胞结果表明,不同时期的细胞冻后存活率差异显著。对数生长后期和静止前期的细胞存活率分别为56%和74%。对数生长早期和衰亡期的细胞存活率分别为12%和11%。而快速冰冻法保存过程中,不同生长时期无显著差异。3.随着预培养时间的延长,悬浮细胞存活率呈抛物线形,在预培养7天时达到了最高值。玻璃化法保存过程中,单培养初期（1～5 d）以蔗糖预培养液最佳,7 d以后与山梨醇预培养液差异不大。总体而言,玻璃化法超低温保存用蔗糖预培养液优于山梨醇预培养液。快速冰冻法以0.8 mol/L山梨醇预培养的细胞体系为最佳。复合预培养中,先蔗糖后0.4 mol/L山梨醇预培养效果最佳。4.用PVS2作冰冻保护剂的玻璃化法超低温保存,悬浮细胞在常温下脱水20min为最佳,冰浴条件下脱水40～60min最佳。冰浴可以提高细胞玻璃化法保存TTC活率。经过预培养的悬浮细胞,可以适当缩短脱水时间,以20～40min为宜。5.不同的预培养方式和冷冻方法均对冻存后细胞的再生长影响很大。其中高渗处理可以在很大程度上提高体系冻存后再生率。恢复生长的细胞分为颗粒状、水渍状两种,随着培养时间的延长,部分水渍状愈伤组织逐渐死亡或转变为颗粒状愈伤组织。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 植物细胞悬浮培养研究进展
• 1.2.1 愈伤组织的诱导和改良
• 1.2.1.1 外植体的选择
• 1.2.1.2 基因型
• 1.2.1.3 愈伤质量与改良
• 1.2.1.4 继代周期
• 1.2.1.5 继代挑选与培养技术
• 1.2.1.6 植物激素
• 1.2.2 影响悬浮体系的因子
• 1.2.2.1 悬浮培养条件
• 1.2.2.2 继代次数
• 1.2.2.3 条件培养基与新鲜培养基比例
• 1.2.2.4 悬浮培养物分散程度
• 1.2.2.5 细胞培养起始浓度
• 1.2.2.6 生长率
• 1.2.3 悬浮体系再生途径
• 1.2.3.1 渗透压
• 1.2.3.2 其它
• 1.3 超低温保存技术在植物种质资源保存中的应用
• 1.3.1 超低温保存植物种质资源的意义
• 1.3.2 植物材料
• 1.3.3 植物材料超低温冻存的细胞学基础
• 1.3.3.1 细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键
• 1.3.3.2 植物细胞超低温保存过程中的致死损伤
• 1.3.4 超低温保存的方法
• 1.3.4.1 传统的降温冰冻方法
• 1.3.4.2 玻璃化保存方法
• 1.3.4.3 其他超低温保存方法
• 1.3.5 影响超低温保存效果的主要因素
• 1.3.5.1 材料的基本特征
• 1.3.5.2 预培养和低温锻炼
• 1.3.5.3 冰冻保护剂的应用
• 1.3.5.4 化冻方法
• 1.3.5.5 再培养
• 1.3.5.6 冻存材料的遗传稳定性
• 1.4 结缕草细胞培养研究进展
• 1.4.1 结缕草离体植株再生
• 1.4.2 结缕草研究热点
• 1.4.2.1 建立结缕草稳定高效再生体系
• 1.4.2.2 完善结缕草遗传转化研究
• 1.4.2.3 加强结缕草基因资源的研究
• 1.5 本研究的主要内容和技术路线
• 1.5.1 研究的主要内容
• 1.5.1.1 日本结缕草悬浮体系的建立
• 1.5.1.2 日本结缕草悬浮体系的超低温保存
• 1.5.2 技术路线
• 1.5.2.1 日本结缕草胚性悬浮体系的建立
• 1.5.2.2 超低温保存
• 2 日本结缕草悬浮体系的建立和体细胞胚的诱导
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 外植体处理
• 2.1.2.1 浸泡处理
• 2.1.2.2 种胚切割处理
• 2.1.3 愈伤组织诱导与继代
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 愈伤组织的改良
• 2.1.6 悬浮体系的建立
• 2.1.7 悬浮体细胞培养体系的优化
• 2.1.7.1 生长量测定
• 2.1.7.2 起始接种密度、生长量、pH 之间的相互关系
• 2.1.7.3 激素
• 2.1.8 显微观察
• 2.1.9 体细胞胚的诱导和植株再生
• 2.1.9.1 再生途径
• 2.1.9.2 激素
• 2.1.9.3 渗透压
• 2.1.10 数据统计
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 结缕草种子浸泡处理
• 2.2.1.1 切割对日本结缕草愈伤诱导率的影响
• 2.2.2 成熟胚胚性愈伤组织的诱导与改良
• 2+浓度对愈伤组织的筛选作用'>2.2.2.1 Cu²⁺浓度对愈伤组织的筛选作用
• 2.2.2.2 继代次数对胚性愈伤诱导率的影响
• 2.2.3 日本结缕草种子体细胞悬浮培养体系的建立
• 2.2.3.1 不同愈伤类型对悬浮体系建立的影响
• 2.2.3.2 继代次数对悬浮体系建立的影响
• 2.2.4 悬浮培养体系的优化
• 2.2.4.1 生长量
• 2.2.4.2 接种密度、生长量、pH 之间的相互关系
• 2.2.5 激素对生长速度和培养周期的影响
• 2.2.6 显微观察
• 2.2.7 体胚的诱导和植株再生
• 2.2.7.1 液体悬浮培养
• 2.2.7.2 固体培养
• 2.2.7.3 渗透压对日本结缕草胚性悬浮体系再生率的影响
• 2.3 结论与讨论
• 2.3.1 结论
• 2.3.1.1 外植体处理
• 2.3.1.2 愈伤组织的诱导
• 2.3.1.3 愈伤组织的继代与改良
• 2.3.1.4 悬浮培养体系建立
• 2.3.1.5 显微观察
• 2.3.1.6 悬浮体系优化
• 2.3.1.7 悬浮培养物颗粒直径对悬浮体系质量的影响
• 2.3.1.8 植株再生
• 2.3.2 讨论
• 2.3.2.1 外植体的选择
• 2.3.2.2 愈伤组织的继代
• 3 日本结缕草悬浮体系的超低温保存
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 悬浮细胞系
• 3.1.2 溶液的配制
• 3.1.2.1 保护剂（PV52）的配制
• 3.1.2.2 TTC 溶液的配制
• 3.1.2.3 pH 7.5 的0.05 mol/L 磷酸缓冲液的配置
• 3.1.2.4 过渡液的配置
• 3.1.2.5 预培养液的配制
• 3.1.3 冷冻前细胞预处理
• 3.1.4 玻璃化法超低温保存方法
• 3.1.5 快速冰冻法
• 3.1.6 干燥法
• 3.1.7 预培养
• 3.1.8 过渡处理
• 3.1.9 TTC 法测定细胞活性
• 3.1.9.1 测定原理
• 3.1.9.2 测定方法
• 3.1.10 细胞冻后存活率测定
• 3.1.11 细胞相对含水量测定
• 3.1.12 冻后细胞再培养和遗传稳定性测定
• 3.1.13 实验设计
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同生长时期对细胞存活率的影响
• 3.2.2 脱水时间和脱水温度
• 3.2.3 过渡处理
• 3.2.4 不同细胞系冻存比较
• 3.2.5 蔗糖预培养和脱水时间
• 3.2.6 预培养时间
• 3.2.7 预培养对悬浮细胞生活力的影响
• 3.2.8 预培养时间和预培养液
• 3.2.9 单预培养和复合预培养
• 3.2.10 预培养-干燥法
• 3.2.11 低温预处理和预培养
• 3.2.12 解冻方式
• 3.2.13 洗涤
• 3.2.14 冻存时间
• 3.2.15 冻后细胞恢复生长
• 3.2.16 冻后遗传稳定性
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 结论
• 3.3.1.1 细胞生长时期对超低温冷冻法冻存悬浮细胞的影响
• 3.3.1.2 不同悬浮细胞系对超低温冷冻效果的影响
• 3.3.1.3 预培养
• 3.3.1.4 低温预处理
• 3.3.1.5 过渡处理
• 3.3.1.6 脱水时间和脱水温度
• 3.3.1.7 化冻方式
• 3.3.1.8 干燥-快速冰冻法
• 3.3.1.9 冻后细胞恢复生长
• 3.3.1.10 超低温保存方案
• 3.3.2 讨论
• 3.3.2.1 细胞生长时期对细胞存活率的影响
• 3.3.2.2 快速冰冻法和玻璃化法
• 3.3.2.3 细胞玻璃化保存中的显微结构变化
• 3.3.2.4 其他保存方法
• 3.3.2.5 冻后材料的遗传稳定性
• 4 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.1.1 日本结缕草悬浮再生体系建立
• 4.1.2 超低温保存
• 4.2 展望
• 4.2.1 悬浮培养研究趋势
• 4.2.2 悬浮体系和日本结缕草研究热点
• 4.2.3 日本结缕草悬浮培养研究建议
• 4.2.4 日本结缕草悬浮体系超低温保存研究建议
• 4.3 创新点
• 参考文献
• 个人简介
• 科研成果
• 导师简介
• 致谢
• 附图
• 悬浮体系建立
• 体胚诱导和植株再生
• 玻璃化法超低温保存