论文摘要
本研究通过透射电子显微镜,Western印迹法,自噬荧光标志蛋白和单丹磺酰尸胺（MDC）荧光染色等实验方法证明严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）3a蛋白以及炭疽致死毒素（LT）在细胞内能够引起细胞自噬,并初步研究了SARS-CoV 3a蛋白引起细胞自噬的信号通路,以及细胞自噬对炭疽致死毒素毒性的影响。细胞自噬是真核细胞中普遍存在的一种通过溶酶体吞噬降解自身成分的机制。细胞自噬具有很多重要的生理功能,其中包括清除病原体的感染。但是由于细胞自噬在进化过程中具有高度的保守性,某些病原体通过进化,具有逃避细胞自噬的能力,甚至利用细胞自噬为病原体复制和发育提供有利条件。细胞自噬的检测有多种方法,包括电子显微镜观察、MDC荧光染色、Western印迹法检测以及自噬荧光标志蛋白的检测等方法。哺乳动物细胞内Atg8的同源物微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein light chain 3,LC3）,是细胞自噬检测的标志蛋白,在细胞自噬过程中会发生特异性的剪切和聚集现象,本研究首先从HeLa细胞的cDNA中扩增出LC3的基因,并克隆至pEGFP-C1载体中,构建了pEGFP-LC3表达质粒,转染HeLa细胞后,通过荧光显微镜观察和Western印迹法证明GFP-LC3蛋白能在HeLa细胞内表达。通过诱导转染pEGFP-LC3表达质粒的HeLa细胞发生细胞自噬,在荧光显微镜下可以观察到GFP-LC3荧光蛋白在细胞内出现点状聚集现象,说明构建的pEGFP-LC3表达质粒可用于检测细胞自噬。SARS-CoV相对于其他冠状病毒具有较强的致死性,这可能与其特有的非结构蛋白有关,3a蛋白是SARS-CoV中最大的一个非结构蛋白。通过文献调研,推测SARS-CoV 3a蛋白能诱导产生细胞自噬。首先通过pCI-3a表达质粒转染Vero E6细胞,检测细胞内是否诱导细胞自噬的产生,但是由于pCI-3a表达质粒在Vero E6细胞转染效率低,SARS-CoV 3a蛋白在细胞内表达水平很低,无法说明在细胞内SARS-CoV 3a蛋白能否诱导产生细胞自噬。为了提高SARS-CoV 3a蛋白的表达效率,将pcDNA5/FRT-3a表达质粒转染Flp-InTM CHO细胞,筛选出稳定表达SARS-CoV 3a蛋白的CHO细胞（CHO-3a）。通过电子显微镜观察,在CHO-3a细胞中观察到自噬泡的出现。将pEGFP-LC3转染CHO-3a细胞,可观察到有荧光蛋白的点状聚集现象,而正常CHO细胞中此现象相对较少。通过MDC荧光染色,CHO-3a细胞可见蓝色荧光,而正常CHO只观察到很微弱的蓝色荧光。Western印迹法结果显示CHO-3a细胞中LC3蛋白特异性的剪切的程度相对于CHO细胞有所增高,以上实验结果初步说明SARS-CoV 3a蛋白在CHO细胞中能够引起细胞自噬现象。通过酵母双杂交方法,发现SARS-CoV 3a蛋白与定位于内质网上的calcium- modulating cyclophilin ligand（CAML）蛋白具有相互作用,通过GST pull-down方法验证SARS-CoV 3a蛋白和CAML蛋白之间的相互作用。随后设计了针对CAML蛋白的siRNA,转染CHO-3a细胞,通过Western印迹检测和自噬荧光细胞质蛋白检测发现CHO-3a细胞中细胞自噬受到抑制。文献报道CAML蛋白能够引起内质网中的Ca2+释放到细胞质中,而细胞质中Ca2+浓度的增加会通过特定的信号通路诱导细胞自噬的产生,在CHO-3a细胞中加入Ca2+螯合剂BAPTA/AM降低细胞质中的Ca2+浓度,Western印迹法检测和自噬荧光标志蛋白观察结果显示细胞自噬受到抑制。有文献报道Ca2+浓度增加激活Ca2+-CaMKK-β-AMPK信号通路对mTOR起负调控,而引起细胞自噬,在CHO-3a细胞中加入AMPK抑制物compound C阻断Ca2+-CaMKK-β-AMPK信号通路的传递,Western印迹法检测和自噬荧光标志蛋白观察结果显示细胞自噬受到抑制。以上的结果初步说明SARS-CoV 3a蛋白与CAML蛋白相互作用,通过Ca2+信号通路引起细胞自噬。炭疽毒素由保护性抗原（PA）、致死因子（LF）和水肿因子（EF）组成。炭疽致死因子是炭疽杆菌致死的最主要毒力因子,但是相对于保护性抗原以及水肿因子,对致死因子的研究还不多,对致死因子的作用机制有待于进一步的深入。本研究采用电子显微镜观察,MDC荧光染色,Western印迹法检测炭疽致死毒素（LT）对于巨噬细胞J774.1细胞的作用,结果显示炭疽致死毒素在J774A.1细胞中能够引起细胞自噬现象,并且随着LT作用时间的增加,细胞自噬的程度也随之提高。炭疽致死毒素（LT）是由PA和LF构成,为了进一步了解LT的作用方式,分别用单独的PA、单独的LF、LF+PA以及LFn+PA分别作用于J774A.1细胞,通过Western印迹法和MDC荧光染色检测,结果显示只有LT能够引起细胞自噬,以上结果提示,LF被PA转运到细胞内才能引起细胞自噬。文献报道LF在巨噬细胞中能够引起氧自由基（ROS）的生成,本研究通过加入ROS清除剂-还原性谷胱甘肽（GSH）清除LT引起的ROS的产生,通过Western印迹法检测,结果显示细胞自噬受到抑制,提示ROS是细胞自噬的刺激因子。本研究通过在LT作用于细胞前诱导或抑制细胞自噬的产生,采用MTT法检测LT半数致死浓度（LC50）的变化情况,研究细胞自噬对于LT毒性的影响,结果显示诱导细胞自噬后LC50明显提高,提示细胞自噬可减弱LT对J774A.1细胞的毒性,说明细胞自噬是细胞抵御LT毒性作用的一种保护机制。