论文摘要
研究背景阿片类药物成瘾是由于长期、反复或失去控制地应用阿片类药物而引起的慢性、复发性脑病,如果不能很好地进行预防和治疗,就会引发较多的医疗、社会和经济问题。阿片类药物成瘾主要表现为生理性依赖和心理性依赖,生理性依赖又称躯体性依赖,主要表现为阿片类药物突然停用时出现的具有特征性的戒断症状,心理性依赖,又称精神性依赖,是指反复使用阿片类药物后产生的一种愉快满足的欣快感觉,这种心理上的欣快感觉会导致机体产生继续使用相关药物的强烈欲望,继而引发强迫用药行为。目前对于生理性依赖状态已经有了多种有效的控制办法,但对阿片类药物造成的心理性依赖还难以清除,因此很容易使患者产生复吸。强啡肽和K阿片受体（KOPr）存在于多巴胺能黑质纹状体系统和中脑边缘系统的多个区域,强啡肽和强啡肽原mRNA在伏核、尾状核、杏仁核、海马以及下丘脑中都有丰富的表达。强啡肽在阿片类药物成瘾中可能通过调制基础和药物诱导的多巴胺神经元功能而起着重要作用。与μ阿片受体配体不同,K阿片受体的特异性配体强啡肽能够降低多巴胺能黑质纹状体系统和中脑边缘系统中多个区域的基础和药物诱导的多巴胺水平。因此KOPr强啡肽系统被认为是阿片成瘾过程中,在直接或间接药物诱导的多巴胺能兴奋后大脑进行反向调节机制的一部分。有研究表明预先给予KOPr激动剂可以降低可卡因成瘾大鼠产生的精神兴奋效应和条件奖赏效应,并降低静脉内可卡因自动给药的速率。因此有假说认为作用于KOPr的配体在成瘾性疾病的特定阶段可能是潜在的药物治疗手段。强啡肽原基因的表达受到钙结合蛋白DREAM （downstream regulatory element antagonist modulator）的调控。DREAM是一种多功能蛋白,它以四聚体的形式结合到基因启动子TATA盒下游的DRE （downstream regulatory element）位点,能够阻断RNA聚合酶Ⅱ复合物的前行,从而抑制目的基因转录。目前已公认DREAM是前强啡肽原（preprodynorphin, PPD）基因表达的转录抑制子,如果对PPD基因的DRE位点进行定点突变后,其基因的表达会明显增强。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在多种生物体细胞内,由双链RNA （double-stranded RNA, dsRNA）分子诱发、通过高效、特异性地阻断或者降低同源mRNA的表达而产生的基因沉默（gene silencing）的现象。因RNAi所诱发的基因沉默发生在转录后水平,因此也被称作转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。在哺乳动物细胞中,进行RNAi目前主要有两种方法：第一种是采用直接制备siRNA的方法,制备的siRNA长度大约为19-23bp,然后再将其转入生物体细胞中；第二种方法是构建编码siRNA的小发夹结构RNA（shRNAs）表达载体,再将其转入生物体细胞中,首先表达产生shRNA,再经过细胞质中核酸酶Dicer识别切割后产生siRNA。通过这两种方法进入细胞内的siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）,利用ATP提供的能量解开siRNA的双链,激活RISC,然后在siRNA反义链的指导下,通过碱基配对,RISC结合到与siRNA同源的目标mRNA上,并在接近中点的位置将目标mRNA切割,使其降解,进而使相应的蛋白质合成减少,目的基因表达沉默。siRNAs的专一性非常高,能有效地抑制特定基因的表达,但不会对非相关基因的表达产生特别的影响。这个结论使得siRNA成为鉴定基因功能的有力工具。进行RNAi治疗的另一关键步骤是要选用合适的递送系统将siRNA完整高效地传递至细胞内。递送系统大致可分为病毒载体递送和非病毒载体递送两大类。非病毒载体递送系统（Nonviral gene delivery systems）包括裸siRNA直接或共价修饰后递送、采用脂质体／脂质复合物递送、采用纳米多聚颗粒递送、采用蛋白和肽类物质递送、采用抗体缀合物递送；病毒载体递送系统包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体以及其他病毒载体。病毒载体转染效率和表达效率较高,是在整体动物和细胞水平进行基因转导的有效工具。其中腺相关病毒载体（AAV）是一种到目前为止没有发现与人类疾病有任何相关性的病毒。它的安全性高,因为它只有很低的细胞毒性；它的宿主细胞范围广,因为其有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力；它的免疫源性低,因为它不会引起细胞强烈的免疫反应,此外,它还能特异性地整合到宿主细胞染色体,在体内长时间表达外源基因,这些特点使AAV广泛应用于基因治疗和疫苗研究中,成为最有希望的基因转移载体之一。基于以上理论基础,我们设想,如果采用RNA干扰技术,使中枢神经系统内DREAM基因表达沉默,从而解除对PPD基因的抑制,使中脑边缘多巴胺通路中多巴胺的释放量减少,是否会有助于改善与多巴胺水平升高有关的渴求行为呢?因此,我们设计了以下两部分的研究来评价RNAi介导海马、伏核DREAM基因表达下调对吗啡成瘾大鼠条件性位置偏好和戒断症状的抑制作用。1.构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA （siRNA）重组腺相关病毒（rAAV）载体,并将其感染体外培养的PC12细胞,观察rAAV感染PC12细胞的效率,并采用Western Blot方法测定DREAM蛋白表达量以观察RNA干扰效应。2.应用大鼠脑立体定向技术通过重组腺相关病毒载体把编码DREAM siRNA的短发夹结构导入大鼠海马和伏核,在体内稳定表达后,建立吗啡成瘾模型,通过观察大鼠行为学表现和条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）,评价基因治疗对大鼠戒断症状和条件奖赏效应的抑制作用。研究方法与结果1.大鼠DREAM基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其干扰效率的鉴定方法：根据大鼠DREAM基因,选择文献报道有效的19nt靶序列作为特异性干扰序列,设计并合成编码DREAM siRNA小发夹结构的正义链和反义链,退火后形成双链,同时在两端加入限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。将经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切的pDC316-EGFP-U6回收载体片段与上述短的双链连接,构建重组质粒pDC316-U6-Dream shRNA-EGFP。设计两条引物,一条与pDC316-U6-Dream shRNA-EGFP质粒的EGFP基因的读码框的5’端特异互补,引入EcoRI位点,另一条引物与pDC316-U6-Dream shRNA-EGFP质粒上U6启动子的5’端特异互补,引入SalI位点,利用已构建好的重组质粒pDC316-U6-Dream shRNA-EGFP,以其为模板,用高保真酶进行扩增。回收PCR产物,用EcoRI和SalI双酶切,再回收,与EcoRI、SalI双酶切pSNAV2.0后回收的载体片段连接,即得到重组载体质粒pSNAV2.0-EGFP-DREAM-shRNA-U6。经过酶切和测序鉴定后,用脂质体包裹携带DREAM shRNA的pSNAV2.0载体质粒,转染BHK-21细胞,利用载体上的新霉素抗性基因标记建立相对稳定的长期基因沉默AAV载体细胞株,然后用具有AAV rep、cap基因和包装功能的辅助病毒——HSV1-rc/ΔUL2对该细胞株进行感染,通过细胞裂解、病毒纯化等步骤,即可得到包含DREAM shRNA的高滴度的rAAV2/1颗粒rAAV2/1-DREAM shRNA-EGFP。再将rAAV2/1病毒颗粒感染体外培养的PC12细胞,经免疫印迹技术（Western blot）检测DREAM基因的蛋白表达水平,以评价rAAV2/1-DREAM- shRNA-EGF的RNA干扰效率。没有包含DREAM shRNA的rAAV2/1-EGFP设立为阴性对照。结果：PCR鉴定和测序证实了大鼠DREAM基因shRNA的重组腺相关病毒载体构建成功,在感染体外培养的PC12细胞后,rAAV2/1-DREAM shRNA-EGFP可以明显抑制DREAM蛋白的表达水平。2.海马、伏核立体定向注射DREAM-shRNA rAAV2/1载体抑制吗啡成瘾大鼠条件性位置偏爱和戒断症状方法：选取符合标准的24只SD大鼠随机分为四组,rAAV2/1-DREAM组、rAAV2/1组、PBS组、对照组。每组6只。rAAV2/1-DREAM组向大鼠双侧海马、伏核各靶点注射rAAV2/1-DREAM shRNA-EGFP, rAAV2/1组注射rAAV2/1-EGFP, PBS组注射PBS；对照组进行立体定向手术,不进行任何注射。2周后rAAV2/1-DREAM组、rAAV2/1组、PBS组大鼠建立吗啡成瘾和位置偏爱模型。三组大鼠按逐日递增原则,腹腔注射（ip）盐酸吗啡,每隔12h注射一次,起始剂量为每次5mg/kg,每日递增5-10mg/kg,连续10d,10d后剂量达到每次90mg/kg。每次注射完吗啡后放下隔板1h,让大鼠停留在伴药侧。1h后提起隔板,使大鼠自由活动。每次注射吗啡前或后3h腹腔注射与吗啡等体积的生理盐水,注射完后关入非伴药侧,时间也是lh。对照组按同样的时间程序进行注射,只是不用注射吗啡,而代之以等体积的生理盐水。最后一次注射吗啡3h后,腹腔给予纳洛酮2mg/kg催瘾,观察并记录戒断症状,共30min,包括跳跃、湿狗样抖、体重减轻、咀嚼。药物注射完成3d后进行条件性位置偏爱测试,直接以大鼠15min（共900s）内在偏爱箱伴药侧停留的时间（秒）表示。各组大鼠在观察结束后立即处死,快速分离大脑海马、伏核组织,采用Western blot方法；检测各组大鼠海马、伏核DREAM蛋白的表达变化。结果：1.成瘾大鼠在纳洛酮作用下诱发戒断症状,rAAV2/1、PBS组大鼠与对照组相比,出现明显的跳跃、湿狗样抖动、体重减轻、咀嚼等戒断症状,而rAAV2/1-DREAM组大鼠与rAAV2/1、PBS组相比,这些成瘾体征明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）；2.CPP训练后,rAAV2/1、PBS组大鼠在伴药箱的停留时间（575.17±66.69s、555.50±49.79s）与对照组（315.33±31.95s）相比明显延长（P<0.01）,表明在吗啡作用下rAAV2/1、PBS组大鼠均对伴药箱产生CPP效应,而rAAV2/1-DREAM组大鼠在伴药箱的停留时间（366.00±26.38s）与对照组（315.33±31.95s）相比,差异无统计学意义（P>0.05）。3. Western blot方法检测结果显示,与PBS组、rAAV2/1组相比,rAAV2/1-DREAM组大鼠海马、伏核DREAM蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。3.统计学分析计量资料以均数±标准差（x±s）表示,采用SPSS11.0软件进行数据处理,组内比较采用配对t检验,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结论本研究成功地构建了包含大鼠DREAM基因shRNA的重组腺相关病毒载体rAAV2/1-DREAM shRNA-EGFP,感染体外培养的具有内源性DREAM表达的细胞,可以在蛋白水平特异、高效地抑制DREAM的表达；应用大鼠脑立体定向技术通过重组腺相关病毒载体把编码DREAM siRNA的短发夹结构导入大鼠海马和伏核,在体内稳定表达后,明显降低海马、伏核中DREAM蛋白的表达量,并改善吗啡成瘾大鼠的戒断症状,抑制条件性位置偏爱的形成,说明siRNA介导的DREAM基因沉默可以有效地抑制吗啡引起的条件奖赏效应。研究总结本研究成功地构建了大鼠DREAM基因的重组腺相关病毒沉默表达载体,并在体外培养细胞和大鼠体内获得了稳定的表达,同时通过目的基因相应蛋白质的表达水平证实了siRNA的干扰作用是有效的,克服了以往RNA干扰技术研究基因功能瞬时性的缺陷。重组腺相关病毒沉默载体导入大鼠脑内,可明显抑制吗啡成瘾大鼠的戒断症状和条件性位置偏爱的形成,是一种有效、可行的转基因治疗药物成瘾的技术,这是对阿片类药物成瘾治疗所进行的一次探索性研究。同时表明DREAM可能是减轻阿片成瘾奖赏效应的潜在治疗靶点。