显微注射海藻糖对卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

论文摘要

目的（1）探讨家兔稳定高效的超促排卵方法，以获得充足的优质家兔卵母细胞；（2）探讨海藻糖的应用能否提高家兔成熟卵母细胞的玻璃化冷冻效果；（3）探讨人工辅助激活技术能否提高冻融后家兔卵母细胞的发育潜能。方法（1）30只新西兰大耳白兔，平均随机分成3组：人绝经期促性腺激素（HMG）+人绒毛膜促性腺激素（HCG）组；孕马血清促性腺激素（PMSG）+HCG组；卵泡刺激素（FSH）+HCG组，比较3组超排卵效果。（2）选择HMG+HCG组及FSH+HCG组超排卵后获取的438枚优质成熟卵母细胞随机分成四组：显微注射海藻糖组（n=143）：将0.15mol/L海藻糖显微注射进入卵母细胞后行玻璃化冷冻，其冷冻保护液含0.5mol/L海藻糖；细胞外海藻糖组（n=127）：卵母细胞未注射海藻糖，其冷冻保护液含0.5mol/L海藻糖；常规蔗糖组（n=118）：卵母细胞行常规玻璃化冷冻，冷冻保护液含0.5mol/L蔗糖；新鲜对照组（n=50）：卵母细胞未行玻璃化冷冻。以cryoleaf为载体，联合使用乙二醇和丙二醇作为冷冻保护剂进行卵母细胞冷冻。（3）卵母细胞冷冻一个月后解冻，复苏后在分裂期培养液中孵育2小时后行卵胞浆内单精子显微注射（ICSI），ICSI后部分卵母细胞入7%无水乙醇作用6分钟（即人工辅助激活）后移入分裂期培养液中培养（激活组），另一部卵母细胞ICSI后直接入分裂期培养液中培养（非激活组）；新鲜对照组直接行ICSI。观察各组卵母细胞冻融后存活率、受精率、卵裂率及囊胚率。结果（1）HMG+HCG组的平均回收卵泡数显著高于FSH+HCG组和PMSG+HCG组，差异有统计学意义（P<0.05）；FSH+HCG组与PMSG+HCG组平均回收卵泡数比较差异有统计学意义（P<0.05）；PMSG+HCG组超排后的卵巢平均充血卵泡数、平均卵巢囊肿数显著高于HMG+HCG组和FSH+HCG组，差异有统计学意义（P<0.05），同时PMSG+HCG组所获部分卵母细胞呈现第一极体碎片、卵周间隙大、胞浆形态异常状况。（2）显微注射海藻糖未激活组、细胞外海藻糖未激活组及常规蔗糖未激活组三组间卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚率差异无统计学意义（P>0.05）；三组冷冻组的卵母细胞受精率、卵裂率、囊胚率均显著低于新鲜对照组（P<0.05）；（3）显微注射海藻糖激活组、细胞外海藻糖激活组及常规蔗糖激活组三组间卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚率差异无统计学意义（P>0.05），但均显著低于新鲜对照组（P<0.05）；（4）显微注射海藻糖激活组与未激活组之间存活率、卵裂率及囊胚率差异无统计学意义（P>0.05），但激活组受精率明显高于未激活组（P<0.05）；细胞外海藻糖激活组与未激活组之间存活率、卵裂率及囊胚率差异无统计学意义（P>0.05），激活组受精率明显高于未激活组（P<0.05）；常规蔗糖激活组与未激活组之间存活率、卵裂率及囊胚率差异无统计学意义（P>0.05），激活组受精率明显高于未激活组（P<0.05）。结论（1）HMG+HCG超排是一种稳定、高效的家兔超排方案；（2）海藻糖作为细胞内冷冻保护剂似乎不能改善家兔卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率、受精率、卵裂率及胚胎的发育潜能；（3）家兔卵母细胞ICSI后联合人工辅助激活技术能够提高冻融后家兔卵母细胞的受精率；（4）家兔卵母细胞冻融后胚胎后期发育潜能显著降低。目的（1）探讨海藻糖的应用能否改善人成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果、提高冻融后卵母细胞的发育潜能；（2）检测卵母细胞融冻后所获胚胎的异常胚胎率，论证该方法的安全性。方法从我中心IVF/ICSI治疗的病人中经知情同意获取卵母细胞189枚，随机分成四组：（1）显微注射海藻糖组（n=63）：将0.15mol/L海藻糖通过显微注射技术注入卵母细胞后行玻璃化冷冻，其冷冻保护液含0.5mol/L海藻糖、15%乙二醇、15%丙二醇；（2）细胞外海藻糖组（n=50）：卵母细胞未注射海藻糖行玻璃化冷冻，其冷冻保护液含0.5mol/L海藻糖、15%乙二醇、15%丙二醇；（3）常规蔗糖组（n=56）卵母细胞行常规玻璃化冷冻，其冷冻保护液含0.5mol/L蔗糖、15%乙二醇、15%丙二醇；（4）新鲜对照组（n=20）：不行玻璃化冷冻。卵母细胞复苏后，所有存活卵母细胞均行卵胞浆内单精子显微注射（ICSI），观察各组卵母细胞冻融后存活率、受精率、卵裂率、囊胚率、优质胚胎率、优质囊胚率。对各组所获囊胚利用荧光原位杂交技术（FISH）对8种染色体进行检测（13,15,16,18,21,22,X,Y），观察各组异常胚胎率。结果（1）三组玻璃化冷冻组间存活率、优质胚胎率、囊胚率差异无统计学意义（P>0.05），显微注射海藻糖组受精率、卵裂率、优质囊胚率高于细胞外海藻糖组和常规蔗糖组，差异均有统计学意义（P<0.05），其中与细胞外海藻糖组受精率、卵裂率差异极显著（P<0.01），与常规蔗糖组卵裂率差异极显著（P<0.01）；细胞外海藻糖组与常规蔗糖组存活率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚率、优质囊胚率差异均无统计学意义（P>0.05）；显微注射海藻糖组与新鲜对照组优质胚胎率、优质囊胚率差异有统计学意义（P<0.05）；细胞外海藻糖组及常规蔗糖组与新鲜对照组受精率、卵裂率、优质胚胎率、优质囊胚率差异极显著（P<0.01）。（2）显微注射海藻糖组的异常胚胎率高于其他三组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。结论（1）海藻糖作为细胞内冷冻保护剂能够改善人卵母细胞玻璃化冷冻效果及冻融后卵母细胞发育潜能；（2）显微注射海藻糖不会加重异常囊胚的发生。

论文目录

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• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 海藻糖联合人工辅助激活在家兔成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 海藻糖应用于人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻及安全性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献