吸水链霉菌5008中井冈霉素生物合成机理的研究

论文摘要

吸水链霉菌井冈变种5008（Streptomyces hygroscopicus var. Jinggangensis Yen）是1973年从我国井冈山分离得到的吸水链霉菌的一个亚种,它产生的井冈霉素是一类水溶性的氨基糖苷类抗生素,在防治水稻纹枯病上已得到广泛应用。目前井冈霉素的生物合成基因簇已被成功克隆并测序,通过对测序结果的分析可以帮助我们对井冈霉素的生物合成机理进行更深入的研究。通过对基因簇的生物信息学分析,基因valG编码的蛋白ValG与大肠杆菌K4中的软骨素聚合酶KfoC有高度的同源性,KfoC的功能是催化软骨素骨架的聚合。ValG含有422个氨基酸,比KfoC的686个氨基酸少264个,位于ValG N端含有250个氨基酸残基的区域是糖基配体的结合区,与糖基转移酶非常相似。另外,ValG中一个保守的模块DGS和两个DXD模块推测分别与NDP-糖基和Mn2+的结合相关,据此我们推测ValG可能参与井冈霉素生物合成过程中最后一步的糖基转移反应。将基因valG中断后,HPLC检测发现井冈霉素的特征峰消失,同时ValG的前体物质有效氧胺大量累积,用带有红霉素强启动子的高拷贝载体将valG回补后,井冈霉素的产生得到恢复,由此证明基因valG确实编码一个糖基转移酶,而且该糖基转移反应为井冈霉素生物合成的限速步骤。将valG在大肠杆菌中异源表达得到可溶性蛋白后,合作单位美国俄勒冈州立大学Taifo Mahmud教授的实验室做了体外的相关实验,进一步证实了基因valG编码的糖基转移酶的功能,并通过TLC实验证明UDP-葡萄糖和GDP-葡萄糖都可以被该酶利用,但比较而言UDP-葡萄糖为该糖基转移酶的最适底物。由基因valL编码的蛋白ValL则与来自Rubrobacter xylanophilus的6-磷酸海藻糖合成酶Rxyl 021033有高度的同源性,另外与大肠杆菌中的OtsA蛋白也有一定的同源性。在大肠杆菌中,6-磷酸海藻糖合成酶OstA和海藻糖磷酸酶OstB负责由6-磷酸葡萄糖和UDP-葡萄糖合成海藻糖的反应,期间有供体糖基的空间异构过程。通过基因置换实验得到的突变株LL2中同样检测不到井冈霉素的产生。用带有红霉素强启动子的整合型载体将valL回补后,井冈霉素的生物合成得到恢复,由此证明valL是井冈霉素生物合成的必需基因。推测其编码的蛋白ValL负责有效胺（validamine）与有效烯酮（valienone）缩合产生有效氧胺（validoxylamine）的反应。基因valH诱导产生的蛋白ValH与菌株S. avermitilis中可能的转运蛋白SAV6900和菌株Mesorhizobium sp. BNC1中的海藻糖透性酶FucP具有33%的一致性和50%的相似性。它们的功能是在H+的帮助下协同运输果糖、葡萄糖或半乳糖。用TMHMM Server v. 2.0分析ValH显示在这个蛋白中有11个跨膜区,属于主要异化超家族（The Major Facilitator Superfamily）。ValH的基因置换突变株LL5中仍可检测到井冈霉素的产生,但是产量有所下降。转运蛋白ValH的功能可能有两方面,一方面可以将胞外的UDP-葡萄糖转运至胞内,通过增加糖基转移酶的底物以提高井冈霉素的产量。另外一方面它也可以将胞内合成的井冈霉素转运到胞外,降低胞内井冈霉素的含量即等于减少糖基转移酶酶促反应的产物,从而诱导酶促反应向合成井冈霉素的方向进行。同时降低胞内井冈霉素的含量也是细胞自我保护的一种机制。吸水链霉菌5008的正常生长温度为30℃,但其实验中的发酵温度为37℃,工业生产上甚至达到42℃,在发酵温度下井冈霉素的产量提高近十倍。通过RT-PCR实验可知井冈霉素生物合成结构基因分为3个操纵子:valABC、valKLMN和valGH,3个操纵子的代表基因valA,valK, valG在37℃的转录水平都明显高于30℃。通过生物信息学分析,我们在井冈霉素生物合成基因簇中找到两个编码双组分调节系统的基因valP和valQ,并对它们分别做了单基因置换和双基因置换。HPLC检测所得2个单基因置换突变株LL3、LL4和双基因置换突变株LL8在37℃的发酵液,井冈霉素产量均下降约50%,用带有红霉素强启动子的整合型载体将基因对应回补后井冈霉素的产量恢复到接近野生型水平。转录方面,3个突变株中的结构基因在37℃的转录水平都较野生型明显降低。由此可知基因valP和valQ确实参与了井冈霉素的温度调节。分析推测,蛋白ValQ为一个组氨酸激酶,接受胞外信号后对其保守的组氨酸残基自体磷酸化,从而自体激活,然后不需要进一步使用ATP就可以将磷酸基团传递到应答调节蛋白ValP的天门冬氨酸残基上,磷酸化的ValP作用于目的基因的RNA片段,从而增强目的基因的转录。井冈霉素产量受温度调控的现象非常特别,目前还没有关于抗生素产量受温度调控的报道。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 链霉菌简介
• 1.2 氨基糖苷类抗生素的分子生物学
• 1.2.1 抗生素简介
• 1.2.2 氨基糖苷类抗生素的生物合成
• 1.2.2.1 链霉素
• 1.2.2.2 新霉素
• 1.2.2.3 卡那霉素
• 1.2.2.4 阿卡泊糖
• 1.2.2.5 井冈霉素/有效霉素
• 1.3 链霉菌次生代谢途径基因表达的调控
• 1.3.1 途径专一调控基因
• 1.3.2 双组分信号传导系统
• 1.3.2.1 AbsA1/A2
• 1.3.2.2 AfsQ2/Q1
• 1.3.2.3 ChiS/R
• 1.3.2.4 CseC/B
• 1.3.2.5 CutS/R
• 1.3.2.6 EcrA1/A2 和EcrE1/E2
• 1.3.2.7 KdpD/E
• 1.3.2.8 OseA/B
• 1.3.2.9 PhoR/P
• 1.3.2.10 VanR/S
• 1.3.3 外源性调节因子
• 1.3.3.1 碳源的影响
• 1.3.3.2 氮源的影响
• 1.3.3.3 磷酸盐的影响
• 1.3.3.4 微量金属离子的影响
• 1.3.4 内源性调节因子
• 1.4 吸水链霉菌井冈变种5008 研究概况
• 1.4.1 吸水链霉菌井冈变种5008 简介
• 1.4.2 吸水链霉菌5008 产生的井冈霉素
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 培养基和化学试剂
• 2.4 实验方法
• 第三章 井冈霉素生物合成基因簇功能分析
• 3.1 前言
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 井冈霉素基因簇的基因及其所编码蛋白的功能
• 3.2.2 井冈霉素基因簇基因的同源分析
• 第四章 井冈霉素生物合成相关结构基因功能分析
• 4.1 前言
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 糖基转移酶基因的功能确定
• 4.2.1.1 基因置换结构的构建
• 4.2.1.2 基因置换菌株的获得及验证
• 4.2.1.3 基因置换菌株的生物学活性测定
• 4.2.1.4 基因置换菌株发酵产物的高效液相色谱分析
• 4.2.1.5 基因置换菌株发酵产物的质谱分析
• 4.2.1.6 基因置换菌株的回补实验及分析
• 4.2.1.7 糖基转移酶基因的异源表达
• 4.2.2 海藻糖合成酶基因的功能确定
• 4.2.2.1 基因置换结构的构建
• 4.2.2.2 通过PCR 靶向突变技术valL 基因置换突变株的获得及验证
• 4.2.2.3 基因置换菌株的生物学活性测定
• 4.2.2.4 基因置换菌株发酵产物的高效液相色谱分析
• 4.2.2.5 基因置换菌株的回补实验及分析
• 4.2.2.6 海藻糖合成酶基因的异源表达
• 4.2.3 转运蛋白基因的功能分析
• 4.2.3.1 基因置换结构的构建
• 4.2.3.2 通过PCR 靶向突变技术valH 基因置换突变株的获得及验证
• 4.2.3.3 基因置换菌株发酵产物的高效液相色谱分析
• 第五章 井冈霉素生物合成相关调节基因功能分析
• 5.1 前言
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 野生型菌株中温度对井冈霉素产量的影响
• 5.2.1.1 不同温度下发酵产物的高效液相色谱分析
• 5.2.1.2 转录水平上温度对井冈霉素生物合成影响的分析
• 5.2.2 双组分调节系统中组氨酸激酶基因valQ 的功能分析
• 5.2.2.1 基因置换结构的构建
• 5.2.2.2 通过PCR 靶向突变技术valQ 基因置换突变株的获得及验证
• 5.2.2.3 组氨酸激酶基因置换菌株发酵产物的高效液相色谱分析
• 5.2.2.4 valQ 基因置换菌株中温度在转录水平上对基因簇的影响
• 5.2.2.5 基因置换菌株的回补实验及分析
• 5.2.3 双组分调节系统中磷酸激酶基因valP 的功能分析
• 5.2.3.1 通过PCR 靶向突变技术valP 基因置换突变株的获得及验证
• 5.2.3.2 磷酸激酶基因置换菌株发酵产物的高效液相色谱分析
• 5.2.3.3 磷酸激酶基因置换菌株中温度在转录水平上对基因簇的影响
• 5.2.3.4 基因置换菌株的回补实验及分析
• 5.2.4 双组分调节系统中双基因突变及功能分析
• 5.2.4.1 通过PCR 靶向突变技术双基因置换突变株的获得及验证
• 5.2.4.2 双基因置换菌株发酵产物的高效液相色谱分析
• 5.2.4.3 双基因置换菌株中温度在转录水平上对基因簇的影响
• 5.2.4.4 双基因置换菌株的回补实验及分析
• 第六章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的研究论文目录
• 攻读学位期间所获奖励