绿豆8S球蛋白基因启动子的克隆及分析

论文摘要

根据绿豆种子8S球蛋白3个亚基基因的末端序列,每个亚基分别设计3个特异反向引物,以绿豆基因组DNA为模板,采用基因组步移（Genome-walking）法,克隆得到获得了绿豆种子8S球蛋白α亚基、α＇亚基和p亚基起始密码子上游分别为472bp、784bp和661bp的DNA片段,三个序列均为首次报道,已被GenBank接收,登录号分别为FJ792642、HQ214071、GU176353.通过启动子预测软件plantCARE、PLACE和softberry等进行序列分析,通过序列测定和生物信息学分析,发现三个序列均含有启动子核心区以及种子特异表达相关的顺式作用元件,如TATA框、CAAT框、RY基序和G盒等,以此推断克隆得到的三个序列都是种子特异启动子序列；为判定其启动活性,分别以三个基因片段为启动子构建了三个种子特异表达载体,并成功将其转化进入绿豆叶片原生质体,三个实验组结果显示外源基因绿色荧光蛋白（GFP）均能够在绿豆叶片原生质体内进行瞬时表达,表明克隆得到的这三个启动子序列具有种子特异性的启动活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 1.1 植物基因启动子分类
• 1.1.1 组成型启动子
• 1.1.2 诱导型启动子
• 1.1.3 组织特异型启动子
• 1.2 植物基因启动子的克隆
• 1.2.1 利用基因组文库筛选启动子
• 1.2.2 利用启动子探针质粒载体筛选启动子
• 1.2.3 利用启动子捕获方法分离和鉴别启动子
• 1.2.4 常规PCR技术
• 1.2.5 反向PCR技术
• 1.2.6 接头PCR技术
• 1.2.7 热不对称交错式PCR技术
• 1.3 启动子的分析与鉴定
• 1.3.1 生物信息学分析与预测
• 1.3.2 实验方法功能分析
• 1.4 种子特异启动子研究概况
• 1.4.1 种子特异启动子序列结构特点
• 1.4.2 种子特异性启动子的顺式调控元件
• 1.4.3 种子特异启动子相关研究报道
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 质粒
• 2.1.5 试剂
• 2.1.6 主要实验仪器
• 2.1.7 试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA的提取
• 2.2.2 引物设计及合成
• 2.2.3. PCR扩增反应
• 2.4.4 电泳检测及目的条带回收
• 2.4.5 感受态细胞的制备
• 2.2.6 连接及转化
• 2.2.7 质粒提取
• 2.2.8 质粒酶切鉴定
• 2.2.9 基因序列测序
• 2.2.10 PEG介导绿豆叶片原生质体瞬时表达
• 3 结果及讨论
• 3.1 绿豆基因组DNA提取结果
• 3.2 启动子序列的克隆
• 3.2.1 引物设计及合成
• 3.2.2 基因组步移法克隆启动子片段
• 3.3 序列测定与分析
• 3.3.1 8SGα序列的测定与分析
• 3.3.2 8SGα’序列的测定与分析
• 3.3.3 8SGαβ序列的测定与分析
• 3.3.4 8SG启动子顺式作用元件生物学功能分析及统计
• 3.4 表达载体的构建
• 3.4.1 pBI-8SGα-omega-GFP载体的构建
• 3.4.2 pBI-8SGα’-omega-GFP载体的构建
• 3.4.3 pBI-8SGβ-omega-GFP载体的构建
• 3.5 原生质体内的瞬时表达
• 4. 讨论与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1:PMD19-T vector图谱
• 附录2:8SGa序列图
• 附录3:8SG α’序列图
• 附录4:8SGp序列图
• 附录5:pMD19-8SGα图谱
• 附录6:pMD19-8SG α’图谱
• 附录7:pMD19-8SGβ图谱
• 附录8:pMD19-8SGα-omega图谱
• 附录9:pMD19-8SGα’-omega图谱
• 附录10:pMD19-8SGβ-omega图谱
• 附录11:pBI-GFP图谱
• 附录12:pBI-8SGα-omega-GFP图谱
• 附录13 pBI-8SG α’-omega-GFP图谱
• 附录14:pBI-8SGβ-omega-GFP图谱
• 在学期间发表论文清单
• 致谢