重组毕赤酵母表达药物蛋白过程的生理代谢特性研究

论文摘要

本论文分析了重组甲醇营养型毕赤酵母在5 L多参数自控发酵罐上生产人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白（HSA-IL2）的发酵过程。在使用多种在线传感器和离线检测参数的基础上,应用相关性分析的方法将细胞生长的关键酶（乙醇氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶）酶活和代谢特性相关联。实验结果显示:（1）在菌体生长阶段,G-6-PDH与ICDH的酶活与菌体的比生长速率μ具有显著的正向相关性;（2）甲醇诱导后葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶活分别下降了46.1%和66.8%,说明胞内代谢流发生了迁移:三羧酸循环（TCA）和磷酸戊糖途径（HMP）中代谢流通量下降,甲醇完全氧化代谢成为主要代谢流;（3）在不同控制策略下,乙醇氧化酶的酶活和重组蛋白HSA-IL2表达量也呈现出一定的差异。高溶氧低甲醇控制方式下HSA-IL2的表达量达到27 mg/L,比低溶氧高甲醇条件下的表达量高33.7%。建立了采用高效液相色谱同时测定重组毕赤酵母表达药物蛋白过程中AMP、ADP、ATP、NAD+和NADH的方法,该方法在15 min内便可对上述五种物质进行有效分离与准确测定。本文通过分析胞内AMP、ADP、ATP、NAD+和NADH浓度的变化描述了重组毕赤酵母在菌体生长以及表达药物蛋白过程中的能荷和氧化-还原态变化趋势。研究发现:（1）细胞自身通过调节能荷和氧化还原水平来调控胞内能量物质（AMP、ADP、ATP、NAD+和NADH）的浓度,引起相应代谢路径代谢通量的改变,进而影响细胞的生长、代谢以及药物蛋白的生物合成;（2）主成分分析（PCA）表明,菌体的呼吸性能在一定程度上体现了菌体胞内生理状态的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统
• 1.1.1 巴斯德毕赤酵母简介
• 1.1.2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优点
• 1.1.3 基因工程巴斯德毕赤酵母的发酵过程
• 1.2 白介素简介
• 1.3 基于细胞生理代谢特性在线控制方式的研究现状及发展趋势
• 1.4 立题意义
• 1.5 本论文的主要研究内容
• 第二章 生理特性参数测定方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 样品处理和制备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 色谱条件的确定
• 2.3.2 定性实验
• 2.3.3 定量实验
• 2.3.4 精密度实验
• 2.3.5 准确度实验
• 2.4 本章小结
• 第三章 重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2 融合蛋白过程的代谢特性
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器与设备
• 3.2.3 微生物菌种
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 毕赤酵母细胞培养方法
• 3.2.6 基于甲醇电极的on-off 在线甲醇浓度控制方法
• 3.2.7 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌体生长期关键酶的酶活性分析
• 3.3.2 菌体生长期与甲醇诱导期关键酶活性对比
• 3.3.3 甲醇诱导期乙醇氧化酶（AOX）酶活性分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组毕赤酵母表达融合蛋白过程的生理特性
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料、仪器与设备、样品处理与制备
• 4.2.2 微生物菌种
• 4.2.3 培养基、细胞培养方法、在线甲醇浓度控制方法
• 4.2.4 甲醇浓度测定、细胞密度的测定、发酵尾气分析、HSA-IL2 含量测定
• 4.2.5 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组毕赤酵母胞内无机磷的浓度（[Pi]）
• 4.3.2 重组毕赤酵母KM71 发酵过程生理特性分析
• 4.3.3 应用主成分分析法（PCA）分析胞内生理状态与菌体呼吸性能的关系
• 4.3.4 重组毕赤酵母 GS115 与 KM71 发酵过程生理特性的比较
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 前景展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 作者在攻读硕士学位期间发表的论文