论文摘要
利用加倍单倍体（DH）群体进行遗传图谱构建，不但有利于图谱的不断加密，便于饱和图谱构建，而且其群体繁殖简便易行，利于不同研究者间合作与交流，从而获得更精确的结果。本实验室曾利用具半配合特性的特殊材料vSg为母本，利用海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1杂交产生F1作父本，创建棉花的一个DH永久性作图群体，初步构建四倍体栽培棉种的分子连锁遗传图谱。但该图谱的作图群体只有58个植株，并且图谱的标记数量及覆盖度较饱和连锁图谱概念仍有一定差距。因此，本研究在原有理论和方法基础上，鉴定出新的单倍体并经加倍获得DH植株，构建了一个包含73个植株的新的DH作图群体，利用新开发出SSR引物进行图谱的构建。新图谱含有444个SSR位点，组成40个连锁群，标记位点间平均距离为7.35cM，覆盖基因组3262.9cM遗传距离。其中，29个连锁群根据单、端体定位结果分别定位到19个染色体上（1-6，9-12，14-18，20，22，23，25和26），10条连锁群根据草棉和雷蒙德氏棉进行的标记分析结果，分别定位到A、D基因组（LGA01、LGA02、LGA03、LGD02、LGD03以及LGD08），一个连锁群LGU01未被定位到任何染色体。为了衡量不同作图群体在棉花遗传作图中的效率，获得更准确、可靠的图谱数据，利用DH群体图谱与利用相同亲本Hai7124和TM-1及SSR标记构建的一个回交群体图谱进行了比较作图分析。比较结果显示，在大部分染色体或连锁群上，两个图谱中共有标记都表现出了良好的共线性；在染色体及基因组水平上分别对标记共线性上的差异分析显示，与含有73个个体的DH群体相比较，含有140个个体的BC1群体由于具有更高的重组值估计能力，在不同染色体及基因组都具有较高的覆盖度。这一结果为不同群体进行棉花遗传图谱的构建、重要农艺性状以及棉种间图谱的比较研究奠定了基础。近几年，棉花分子遗传图谱构建取得了巨大的进展，含有数千个分子标记的高密度图谱业已成功构建。但是，仍有六条连锁群未能与具体染色体建立联系，严重阻碍了棉花完整遗传图谱的构建。根据减数分裂荧光原位杂交（FISH）结合易位杂合体材料的物理定位策略，我们利用连锁群特异SSR标记筛选出连锁群特异BAC克隆，成功将连锁群进行了染色体的定位。在此，开发了一系列相关技术，其中多数属国内外首次报道：首先，为了从一个棉花BAC文库中筛选SSR标记的阳性克隆，我们开发了一种高通量的BAC-DNA提取方法，该方法利用了96深孔板和自动移液系统，实现在8h内完成多达960个样品DNA的提取；同时，建立了两维法的文库筛选策略，并以SSR反应体系为基础，建立了多引物PCR文库筛选方法，利用该方法快速、准确地筛选到所需阳性克隆。其次，成功构建了棉花有丝分裂中期和减数分裂中期Ⅰ的细菌人工染色体原位杂交（BAC-FISH）技术体系，信号分析显示该方法具有较高的检出率及稳定性。其中棉花有丝分裂染色体BAC-FISH技术属国内首次应用，减数分裂的BAC-FISH技术为国际首次报道。最终，在这一系列技术成功开发基础上，我们利用遗传图中六条未定位到染色体上的连锁群上特异的SSR标记筛选一个以陆地棉材料TM-1构建的BAC文库，得到相应连锁群特异BAC克隆，并以之为探针与一套陆地棉的易位杂合体材料杂交，将这六条连锁群A01，A02，A03，D02，D03及D08分别定位到染色体13，8，11，21，24和19上。国际上首次将四倍体棉遗传图谱连锁群全部定位到相应染色体上。并且，以四倍体棉13对部分同源染色体为基础，提出了一种新的易于使用和交流四倍体棉染色体的命名方法，即A组染色体按照原命名顺序重新命名为A1至A13，而D组染色体按对应A组染色体的部分同源关系依次命名为D1至D13。染色体识别是基因组核型分析的基础。由于棉花染色体数量大加之形态较短小，缺乏差异，常规的带型等染色体识别方法无法应用，使得其染色体的正确识别及进一步的核型研究工作难以实现。BAC-FISH技术在染色体的识别中显现出了难以比拟的优越特性，在前述连锁群（染色体）特异BAC克隆开发基础上，我们从一个棉花高密度遗传图谱上选择各染色体特异SSR标记，并筛选另一个以雄性不育恢复系材料0-613-2R构建的BAC文库，开发出一套完整的四倍体棉染色体特异BAC克隆，利用其BAC-FISH杂交信号作为染色体的特异细胞学标记，准确地识别出棉花26条染色体，这也是第一套关于多倍体植物物种染色体特异BAC克隆的报道。同时，BAC-FISH技术的应用亦实现了物理图谱与遗传图谱的比较作图分析。本研究发现，在我们开发的这一套26个染色体特异克隆中，尽管部分标记在遗传图中位于连锁群的中部，但相应克隆的原位杂交定位显示，其位于染色体的末端或近末端处，暗示棉花基因组中染色体的远端往往是重组活跃区段。另外，利用遗传图上末端标记的染色体物理定位分析，进行了遗传图谱饱和度的评估。对来自染色体A6上的两个末端标记的阳性BACs 47N15和75F07进行了物理定位，结果显示，它们位于染色体的末端，证明该连锁群上的标记已基本覆盖该染色体。利用一个与杂种优势相关的EST序列的特异引物Y2232筛选文库获得阳性克隆36D03，并利用BAC-FISH将其定位染色体A7长臂上，与遗传图谱定位结果一致。由于BAC插入片段通常为100kb左右，与直接利用较小的目的基因等序列片段进行原位杂交相比，信号更易识别，结果更为可靠，这亦为目的片段的物理定位提供了有力的工具及新的途径。同时，我们对两种不同类型、揭示部分同源关系的BAC克隆进行了FISH定位分析。结果暗示，SSR标记产生的两个等位位点往往来自部分同源染色体。而另一发现显示，虽然经过长期的进化演变，四倍体棉部分同源染色体上仍然存在大片段的高度同源区段。这一发现为部分同源关系的确定提供了新的证据，同时也为棉花多倍体形成与进化等研究提供了新的线索。