贲门癌蛋白指纹模型的建立与肿瘤相关标志物的筛选

论文摘要

背景与目的：贲门癌（Gastric cardia adenocarcinoma，GCA）是我国北方常见的恶性肿瘤之一，80年代以来，我国胃远侧部位肿瘤发生率呈明显下降趋势，但GCA发病率仍维持在较高水平。研究提示，贲门癌变是一多阶段、多因素参与的过程。SELDI-TOF-MS技术是近年发展起来的一种蛋白组学研究方法。具有样品用量小、操作简便、高灵敏度、高通量等优点，可同时筛选出众多的标志物。为GCA的研究提供了重要技术平台。关于GCA的蛋白质组学研究报道很少。本研究采用SELDI-TOF-MS技术对GCA患者和健康人的血清进行检测，以期建立GCA蛋白诊断模型；并对GCA不同分化程度及有无淋巴结转移进行蛋白质组对比分析，以期发现与其密切相关的标志物。在上述基础上本研究利用生物学信息及RT-PCR技术查询并确定GCA相关蛋白，寻找能辅助GCA早期诊断的标志物。材料与方法：GCA患者：47例，男36例，平均年龄61±8岁；女11例，平均年龄61±10岁。所有患者术前均未经放疗和化疗，并排除急慢性炎症（肝炎等）等。术后病理检查均为贲门腺癌，合并有淋巴结转移23例。健康对照组：50例，男29例，平均年龄56±11岁；女21例，平均年龄60±10岁。取空腹静脉血2-5ml，4℃静置1-2h，2000r／min离心30min，将血清100μl分装后-80℃冰箱保存。组织标本20例（10例为GCA组织，10例为对应的癌旁正常贲门组织），男6例，女4例，平均年龄60±7岁。取10μl血清样品，加20μl U9（9M尿素，2％CHAPS，50mM Tris-HCl调到pH9.0）缓冲液，4℃振荡30min，使蛋白变性。取上清液10μl加120μl结合缓冲液（50mM NaAC，PH3.5）震荡混匀5min备用。每孔依次加入50μl100mmol／LCuS04，50μl 100mmol／L醋酸钠（pH4.0），150μl结合／洗脱缓冲液（50mmol／LHEPES，pH7.0），最后每孔加入50μl稀释好的样品，4℃孵育60min后除去，缓冲液冲洗。取出芯片风干，备检。利用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪进行检测，蛋白质的分子量区间为1500-20000Da。采用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，设定仪器参数，在CipherGen ProteinChip软件中设定程序读取芯片数据，由计算机根据所获得的原始数据绘制出蛋白质质谱图，纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。候选相关蛋白质检索：根据差异蛋白的相对分子质量，在SWISS-PROT和TrEMBL蛋白数据库中通过http://us.expasy.org/tools/tagident.html网站检索与其相匹配蛋白质，分子量允许的误差范围＜0.5％。RT-PCR技术：RNA提取及反转录分别按Promega公司SV Total RNA Isolation System及ImProm-IITM Reverse Transcription System试剂盒建议进行。PCR引物由上海生物工程公司合成Gastric cancer-related protein（VRG118）forward：5’-GGC TCC ATG GTC TGA GTT GT-3’，reverse：5’-TTA ATA CCA CTC CCC CAA CG-3’，扩增片段为194bp。反应体系为10×Reaction buffer 2μl，10mmol／L dNTPs 2μl，25mmol／L MgCl2 1.6μl，forward primer 0.8μl，reverse primer 0.8μl，Taq DNA Polymerase 0.1μl，Template DNA 2μl，Sterile deionized Water 10.7μl，共20μl。条件为：95℃预变性3min，（94℃30s，60℃35s，72℃45s）30个循环，72℃延伸8min。产物经1％的普通琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过凝胶成像系统分析电泳结果。数据处理与统计学分析：所有检测数据先用Proteinchip Software 3.1进行统一校正，使总离子强度及分子量均一化。再用Biomarker Wizard软件方差分析，计算不同组相同质荷比的蛋白质含量的P值。P＜0.05被认为差异具有显著性。各组间蛋白表达差异等数据采用SPSS10.0统计软件处理，采用X2检验和Kappa检验等统计学方法对资料进行统计学分析。结果：以M5908.48，M7943.64和M8938.70蛋白质组成的决策树模型对GCA患者测试的准确率、敏感度和特异度分别为77.3％、85.1％和70.0％。差异蛋白中相对分子质量为M4211.29，M5334.13，M5966.63，M5903.14，M11735.71，M5922.70，M7932.54，M7758.66，M9287.40和M6109.99的蛋白质（上调组蛋白）相对含量在3组中比较为：对照组＜中分化组＜低分化组；相对分子质量为M8992.89，M8158.48，M8924.27，M4495.96，M9434.40，M5099.02，M6661.72，M6222.12和M6960.60的蛋白质（下调组蛋白）相对含量在3组中比较为：对照组＞低分化组＞中分化组。相对分子质量（M／Z）为M7762.68的蛋白质在GCA组中的含量明显高于健康对照组，根据其相对分子质量在SWISS-PROT和TrEMBL蛋白数据库中查询，发现VRG118，与实验结果最为符合。RT-PCR检测显示VRG118在10例GCA组织中4例为阳性，阳性率为：40％（4／10）：10例贲门正常组织均为阴性。结论：M5908.48，M7943.64和M8938.70蛋白质组成的决策树模型用于GCA的诊断具有较高的准确度、灵敏度和特异度；GCA中、低分化之间蛋白质组差异较大，该组蛋白质可能与GCA细胞的增殖和侵袭程度有关；RT-PCR技术在GCA组织检测的VRG118 mRNA的表达水平与GCA患者血清结果一致，提示：VRG118与GCA的发生发展密切相关，可作为GCA的肿瘤标志物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 第2章 SELDI-TOF蛋白芯片仪的组成及工作原理
• 2.1 简介
• 2.2 蛋白质芯片
• 2.3 蛋白质芯片解读仪（proteinchip reader）
• 2.4 蛋白质芯片软件控制分析系统（Software）
• 第3章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 血清标本资料
• 3.1.2 贲门癌及癌旁正常组织标本
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 各种溶液的配制
• 3.1.6 实验使用的各种软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 SELDI-TOF-MS技术检测血清标本
• 3.2.2 侯选蛋白查询
• 3.2.3 侯选蛋白的组织学验证—RT-PCR
• 第4章 结果
• 4.1 波峰检测
• 4.2 贲门癌组与对照组对比
• 4.2.1 波峰整合与蛋白质质谱分析
• 4.2.2 生物标志物的发现及诊断模型的建立
• 4.2.3 预测准确率
• 4.2.4 准确率和敏感度及特异度
• 4.3 贲门癌不同分化程度的对比研究
• 4.4 贲门癌淋巴结转移组与未转移组对比研究
• 4.5 候选蛋白查询
• 4.6 RT-PCR
• 第5章 讨论
• 5.1 SELDI-TOF-MS技术对贲门癌患者和健康对照组血清对比分析
• 5.2 肿瘤标志物的筛选及组织学鉴定
• 第6章 结论
• 参考文献
• 附录A 图表
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果
• 详细摘要